Isolamento, caracterização e regulação do gene que codifica nitrato redutase em Crinipellis perniciosa

• Autor(a) principal: Silva, Viviane Aline Oliveira
• Data de Publicação: 2005
• Tipo de documento: Dissertação
• Idioma: por
• Título da fonte: LOCUS Repositório Institucional da UFV
• Texto Completo: http://www.locus.ufv.br/handle/123456789/10709
• topic: Nitrato Redutase; Sistema de Transformação; Caracterização; Ciências Agrárias

Neste trabalho foram realizadas a clonagem e a caracterização parcial de um fragmento de 7,1Kb contendo o gene que codifica a nitrato redutase no fungo basidiomiceto Crinipellis perniciosa. A análise da seqüência parcial desse fragmento revelou a organização em cluster do gene nia com o gene que codifica a nitrito redutase e permitiu uma comparação filogenética com seqüências homólogas em outros fungos filamentosos. Foi realizada, também, a análise parcial comparativa das seqüências putativas das proteínas homólogas ao regulador geral positivo AREA, ao regulador específico NIRA e ao transportador de nitrato CRNA, depositadas no banco de dados do projeto genoma de C. perniciosa. O alinhamento das seqüências revelou maior proximidade genética de C. perniciosa ao fungo basidiomiceto Hebeloma cylindrosporum. A caracterização do gene nia em dez isolados de C. perniciosa de distintos biótipos e regiões geográficas por PCR-RFLP e hibridização revelou polimorfismo para os isolados do biótipo-S e biótipo-L. Não foi possível agrupar os isolados por hospedeiro ou região geográfica a partir da comparação das seqüências do gene que codifica a nitrato redutase, porém, os dados evidenciaram variabilidade genômica intraespecífica nessa espécie. A transformação da linhagem mutante niaD- de Penicillium griseoroseum, PG63, com o plasmídeo contendo o fragmento de 7,1 Kb resultou no isolamento de poucos transformantes. A complementação da mutação em P. griseoroseum, com o gene heterólogo do basidiomiceto C. perniciosa demonstrou que o gene niaCP é expresso e funcional, sugerindo estar sujeito a um controle de regulação similar ao do gene niaD desse organismo. A análise da regulação do gene nia de C. perniciosa por RT-PCR foi feita a partir de RNA total extraído de micélio cultivado em diferentes fontes de nitrogênio. O transcrito detectado na presença de nitrato como indutor e ausência de fontes de nitrogênio prontamente metabolizáveis sugere uma via de regulação específica e geral. A transcrição do gene niaCP foi ativada também no micélio cultivado no meio acrescido do fruto de cacau liofilizado e moído. Estes resultados sugerem uma provável importância da enzima nitrato redutase para C. perniciosa durante o seu desenvolvimento no hospedeiro.