Purification, characterization and evaluation of the differential expression of proteases produced by Pseudomonas fluorescens

• Autor(a) principal: Alves, Maura Pinheiro
• Data de Publicação: 2017
• Tipo de documento: Tese
• Idioma: eng
• Título da fonte: LOCUS Repositório Institucional da UFV
• Texto Completo: http://www.locus.ufv.br/handle/123456789/9964
• topic: Leite; Microbiologia; Tecnologia de alimentos; Pseudomonas fluorescens; Ciência e Tecnologia de Alimentos

As bactérias psicrotróficas contaminantes do leite produzem proteases termo- resistentes que hidrolisam as caseínas do leite, resultando em perda de qualidade de leite e rendimento de produtos lácteos. Estudos envolvendo a caracterização dessas enzimas e o conhecimento das condições que influenciam sua produção e atividade são essenciais para a prevenção destes problemas. Neste trabalho, uma protease extracelular produzida pela cepa Pseudomonas fluorescens 07A foi purificada para estudos visando o entendimento de sua atividade e produção em diferentes condições. A enzima é uma metaloprotease inibida por Cu 2+ , Ni 2+ , Zn 2+ , Hg 2+ , Fe 2+ e Mg 2+ , mas induzida por Mn 2+ e possui massa molar de 49.486 kDa. O seqüenciamento da enzima por espectrometria de massa permitiu identificar o gene que codifica esta protease extracelular no genoma da cepa P. fluorescens 07A. A enzima possui 477 aminoácidos e domínios altamente conservados de ligação a Ca 2+ e Zn 2+ , indicando que Ca 2+ , o principal íon no leite, é também um co-fator dessa enzima. Sua atividade é máxima a 37 oC e pH 7,5, mas ela mantém mais de 40% de atividade quando submetida a 100 oC por 5 minutos em meio ideal e apenas de 14 a 30% quando submetida a tratamentos térmicos mais brandos, podendo causar problemas significativos nas condições normalmente utilizadas para o processamento e armazenamento de leite e produtos lácteos. Foi observada baixa expressão relativa da protease após 12 h de incubação a 25 oC, quando a bactéria encontra-se na fase logarítmica de crescimento, comparado com as temperaturas de refrigeração de 4 e 10 oC, quando a bactéria está ainda em fase lag. A produção da protease aumentou significativamente (P <0.05) em 24 h a 25 oC e permaneceu constante por até 48 h, intervalo em que a bactéria permaneceu em fase estacionária, indicando que a enzima pode ser produzida como uma estratégia adaptativa da bactéria. As frações de caseína de leite desnatado reconstituído foram completamente degradadas pela P. fluorescens 07A, pela protease purificada e pelo extrato da bactéria em até sete dias de incubação a 25 oC, e em menor extensão a 10 °C para a amostra incubada com a bactéria. O tratamento térmico de 90 oC por 5 minutos inativou a enzima purificada e inibiu sua atividade no extrato da bactéria. Este trabalho permitiu compreender as características bioquímicas e biológicas de uma protease extracelular da cepa P. fluorescens 07A, bem como as condições que influenciam a produção de proteases por esta bactéria em leite e sua atividade. Esses resultados podem auxiliar as indústrias de lácteos na busca por alternativas durante o processamento de produtos lácteos visando o controle de sua produção e atividade.