Detecção de Ralstonia solanacearum em plantas infectadas de eucalipto via PCR em tempo real

• Autor(a) principal: Pereira, Camila Santana
• Data de Publicação: 2011
• Tipo de documento: Dissertação
• Idioma: por
• Título da fonte: LOCUS Repositório Institucional da UFV
• Texto Completo: http://locus.ufv.br/handle/123456789/4789
• topic: Ralstonia solanacearum; Eucalipto; PCR em tempo real; Ralstonia solanacearum; Eucalyptus, real-time PCR; CNPQ::CIENCIAS BIOLOGICAS::GENETICA::GENETICA VEGETAL

A murcha bacteriana causada por Ralstonia solanacearum é, atualmente uma das mais importantes doenças bacterianas na eucaliptocultura. O uso de mudas clonais sadias é ométodo mais efetivo para evitar a introdução e disseminação do patógeno em áreas livres da doença. Plantas infectadas podem ser identificadas visualmente ou pela exsudação de pus, porém, em minicepas assintomáticas, mas com infecções latentes, nas quais o xilema apresenta baixas concentrações de células bacterianas, não é possível a visualização de sintomas de murcha ou sinais da doença como a exsudação bacteriana. Assim, para certificação de que as mudas para o plantio estão livres do patógeno, é necessário empregar um método capaz de detectar a bactéria, mesmo quando presente em baixas concentrações.Assim, o presente trabalho objetivou avaliar a PCR em tempo real para detecção da bactéria no período latente de infecção. Primeiramente, dentre seis oligonucleotídeos testados, o oligo 224R/224F, que amplifica a região do gene ribossomal 16S, foi o único específico para R. solanacearum. Subsequentemente desenvolveu-se um protocolo de extração de DNA bacteriano a partir do tecido vegetal infectado que consiste da maceração com nitrogênio líquido, adição de solução salina, centrifugação, descarte do sobrenadante e extração com o kit (Promega) de extração. Para avaliar o método da PCR em tempo real, mudas de eucalipto de quatro clones foram inoculadas com o isolado UFV32 de R. solanacearume o DNA do patógeno foi quantificado aos 20 dias da inoculação. Aproximadamente 105 a 106 unidades formadoras de colônia (ufc)/g de R. solanacearum foram detectadas.. O limite de detecção da PCR em tempo real foi de 103ufc/g contra 107ufc/mL da PCR convencional, ou seja 10.000 vezes maior.. O método mostrou-se eficiente na detecção e quantificação de R. solanacearum diretamente do tecido vegetal de eucalipto.