Caracterização funcional de Rad53 de Cryptococcus neoformans
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| Data de Publicação: | 2017 |
| Tipo de documento: | Trabalho de conclusão de curso |
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Resumo: | Trabalho de Conclusão de Curso (graduação)—Universidade de Brasília, Faculdade de Ceilândia, 2017. |
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Pimentel, Narla Verorrayne GonçaloMatos, Larissa FernandesPIMENTEL, Narla Verorrayne Gonçalo. Caracterização funcional de Rad53 de Cryptococcus neoformans. 2017. 76 f., il. Trabalho de Conclusão de Curso (Bacharelado em Farmácia)—Universidade de Brasília, Brasília, 2017.https://bdm.unb.br/handle/10483/23937Trabalho de Conclusão de Curso (graduação)—Universidade de Brasília, Faculdade de Ceilândia, 2017.Rad53 é uma proteína quinase presente em eucariontes que é fosforilada e ativada em resposta ao dano do DNA. Quando os eventos do ciclo celular são interrompidos, as proteínas do ponto de controle bloqueiam a progressão do ciclo celular até o processo de reparo do DNA ser concluído. Em Saccharomyces cerevisiae, Rad53 desempenha papéis importantes nas fases G1, S e G2 do ciclo celular, medeia a maioria das respostas após o dano ao DNA e está envolvido na tolerância à exposição a UV. Este trabalho, apresenta os dados relacionados à caracterização funcional de Rad53 em Cryptococcus neoformans. Não é um gene essencial, pois o mutante rad53Δ foi obtido por recombinação homóloga do marcador de resistência a Hygromicina B (HPH). A integração do marcador HPH no lócus RAD53 foi confirmada por PCR e Southern Blot. O mutante não apresentou defeito de crescimento em relação à alta temperatura, estresse oxidativo (H2O2), estresse osmótico (KCl, NaCl) e estresse da parede celular (Congo Red e Calcofluor white). Também foi avaliada a produção de fatores de virulência em rad53Δ como urease, fosfolipase, melanina e cápsula. A cápsula foi observada diminuída em comparação com a cepa do tipo selvagem. A resposta do mutante rad53Δ a estressores genotóxicos, incluindo hidroxiuréia (HU) que inibe a síntese de DNA, sulfato de metilmetano (MMS) que interrompe o ciclo celular devido à alquilação de DNA e radiação UV, também foram avaliadas. O mutante rad53Δ mostrou um defeito de crescimento em 0,04% de MMS, a 150 e 200 mM de HU e após exposição à radiação UV (60-360 J / m2) em comparação com o tipo selvagem. Quando as células não sincronizadas foram tratadas com MMS 0,04% por 1 h, a citometria de fluxo não detectou diferença na distribuição das células em relação às fases do ciclo celular ao comparar as linhagens H99 e rad53Δ. Entretanto, ao avaliar células sincronizadas e não tratadas com MMS, o mutante rad53Δ parece apresentar um atraso para retomada do ciclo celular, apresentando uma maior população de células em G2. Além disso, foi avaliada a susceptibilidade às drogas antifúngicas de rad53Δ, entretanto este não difere do seu selvagem H99, assim como no ensaio de sobrevivência após fagocitose por macrófagos M1. Assim, estes dados demonstram que Rad53 desempenha papel importante na resposta de C. neoformans aos agentes genotóxicos e sua ausência afeta a expressão de um dos fatores de virulência mais bem estudados neste fungo, a cápsula polissacarídica, indicando que a expressão de fatores de virulência e regulação do ciclo celular estão intimamente relacionadas.Submitted by Caroline Botelho Teixeira (carolinebotelhoteixeira@gmail.com) on 2020-05-08T17:13:34Z No. of bitstreams: 1 2017_NarlaVerorrayneGoncaloPimentel_tcc.pdf: 3457539 bytes, checksum: bb9fd2725f0e73e13ee6d15943a643a8 (MD5)Approved for entry into archive by Luanna Maia (luanna@bce.unb.br) on 2020-05-12T20:21:24Z (GMT) No. of bitstreams: 1 2017_NarlaVerorrayneGoncaloPimentel_tcc.pdf: 3457539 bytes, checksum: bb9fd2725f0e73e13ee6d15943a643a8 (MD5)Made available in DSpace on 2020-05-12T20:21:24Z (GMT). No. of bitstreams: 1 2017_NarlaVerorrayneGoncaloPimentel_tcc.pdf: 3457539 bytes, checksum: bb9fd2725f0e73e13ee6d15943a643a8 (MD5)Rad53 is a protein kinase present in eukaryotes that is phosphorylated and activated in response to DNA damage. When cell cycle events are disrupted, the check point proteins block cell cycle progression until the DNA repair process is completed. In Saccaromyces cerevisiae, Rad53 plays important roles in the G1, S and G2 phases of the cell cycle, mediates most responses after DNA damage and is involved in tolerance to UV exposure. This work presents the data related to the functional characterization of Rad53 in Cryptococcus neoformans. It is not an essential gene since the mutant rad53Δ was obtained by homologous recombination of the resistance marker to Hygromycin B (HPH). Integration of the HPH marker on the RAD53 locus was confirmed by PCR and Southern Blot. The mutant showed no growth defect conditions of to high temperature, oxidative stress (H2O2), osmotic stress (KCl, NaCl) and cell wall stress (Congo Red and Calcofluor white). The production of virulence factors such as urease, phospholipase, melanin and capsule were also evaluated. Only the capsule was decreased compared to the wild-type strain. The rad53Δ response to genotoxic stressors, including hydroxyurea (HU) which inhibits DNA synthesis, methyl methane sulfate (MMS) that disrupts the cell cycle due to DNA alkylation and UV radiation, has also been evaluated. The rad53Δ mutant showed a growth defect in 0.04% MMS, at 150 and 200 mM HU and after exposure to UV radiation (60-360 J / m2) as compared to the wild type. When the non-synchronized cells were treated with 0.04 % MMS for 1 h, flow cytometry did not detect difference in cell distribution relative to the cell cycle phases when comparing the H99 and rad53Δ. However, when evaluating cells synchronized and not treated with MMS, the rad53Δ mutant appears to present a delay to the recovery of the cell cycle, with a larger population of cells in G2. In addition, the susceptibility to the antifungal drugs of rad53Δ was evaluated, however this did not differ from wild type H99, as well as in the survival assay after phagocytosis by M1 macrophages. Thus, these data demonstrate that Rad53 plays an important role in the response of C. neoformans to genotoxic agents and its absence affects the expression of one of the best-studied virulence factors of this fungus, the polysaccharide capsule, indicating that the expression of virulence factors and cell cycle regulation are closely related.A concessão da licença deste item refere-se ao termo de autorização impresso assinado pelo autor que autoriza a Biblioteca Digital da Produção Intelectual Discente da Universidade de Brasília (BDM) a disponibilizar meu trabalho de conclusão de curso por meio do sítio bdm.unb.br, com as seguintes condições: disponível sob Licença Creative Commons 4.0 International, que permite copiar, distribuir e transmitir o trabalho, desde que seja citado o autor e licenciante. Não permite o uso para fins comerciais nem a adaptação desta.info:eu-repo/semantics/openAccessFungos patogênicosMicosesVirulência (Microbiologia)Caracterização funcional de Rad53 de Cryptococcus neoformansinfo:eu-repo/semantics/publishedVersioninfo:eu-repo/semantics/bachelorThesis2020-05-12T20:21:24Z2020-05-12T20:21:24Z2017-06-29porreponame:Biblioteca Digital de Monografias da UnBinstname:Universidade de Brasília (UnB)instacron:UNBLICENSElicense.txtlicense.txttext/plain1817http://bdm.unb.br/xmlui/bitstream/10483/23937/2/license.txt21554873e56ad8ddc69c092699b98f95MD52ORIGINAL2017_NarlaVerorrayneGoncaloPimentel_tcc.pdf2017_NarlaVerorrayneGoncaloPimentel_tcc.pdfapplication/pdf3457539http://bdm.unb.br/xmlui/bitstream/10483/23937/1/2017_NarlaVerorrayneGoncaloPimentel_tcc.pdfbb9fd2725f0e73e13ee6d15943a643a8MD5110483/239372020-05-12 17:21:24.107oai:bdm.unb.br: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Biblioteca Digital de Monografiahttps://bdm.unb.br/PUBhttp://bdm.unb.br/oai/requestbdm@bce.unb.br||patricia@bce.unb.bropendoar:115712020-05-12T20:21:24Biblioteca Digital de Monografias da UnB - Universidade de Brasília (UnB)false |
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