Isolamento e caracterização molecular do vírus da cinomose canina, análise de antivirais e produção de uma proteína M recombinante

Detalhes bibliográficos
Autor(a) principal: Costa, Vivaldo Gomes da
Data de Publicação: 2021
Tipo de documento: Tese
Idioma: por
Título da fonte: Repositório Institucional da UnB
Texto Completo: https://repositorio.unb.br/handle/10482/41808
Resumo: Tese (doutorado)—Universidade de Brasília, Programa em Rede Multi-Institucional do Pró-Centro-Oeste de Pós-Graduação em Biotecnologia e Biodiversidade, 2021.
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spelling Isolamento e caracterização molecular do vírus da cinomose canina, análise de antivirais e produção de uma proteína M recombinanteCanine morbillivirusCinomose canina - vírusParamixovirusCães domésticosFilogenia viralExpressão proteicaTese (doutorado)—Universidade de Brasília, Programa em Rede Multi-Institucional do Pró-Centro-Oeste de Pós-Graduação em Biotecnologia e Biodiversidade, 2021.O canine distemper virus (CDV), gênero Morbillivirus, tem emergido e sido reconhecido como um patógeno altamente contagioso e letal de cães domésticos (Canis familiaris). CDV também infecta e ameaça uma grande variedade de animais selvagens, incluindo, por exemplo, as famílias Canidea (cães selvagens, raposa, lobo, cão-guaxinim), Mustelidae (furão, gambá, visom, lontra) e Procyonidae (guaxinim, quati). Estudos sobre o CDV são necessários por conta das diversas lacunas envolvendo o assunto, entre as quais estudos de prevalência e caracterização molecular, terapias antivirais e produção de insumos laboratoriais para o diagnóstico. Dessa forma, o presente estudo foi realizado e está constituído em seis capítulos. No primeiro capítulo foi realizada a revisão bibliográfica envolvendo a temática em questão. O segundo capítulo se refere à combinação dos dados obtidos do inquérito molecular, incluindo também os dados da literatura sobre dectecção molecular e sorológica do vírus nas diversas regiões do mundo. Embora este capítulo tenha sido publicado na forma de meta-análise, destaca-se a inserção dos nossos dados experimentais no estudo, permitindo a geração de dados mais robustos quanto à frequência de positividade viral, juntamente com a análise de diversas variáveis potencialmente envolvidas com o fator infecção viral. Ainda em relação ao segundo capítulo, frisa-se que o mesmo envolveu a coleta de amostras biológicas de cães com suspeita clínica de cinomose, procedentes do município de Jataí-Goiás. Em suma, houve 34% (48/141) de positividade para o RNA viral nas amostras. Essas amostras também serviram de base para a realização dos capítulos três e quatro. O terceiro capítulo envolveu o isolamento e sequenciamento completo do CDV. Para tanto, pela primeira vez foram desenvolvidos dezenas de primers que permitiram flanquear todo o material genético. Assim, houve sucesso na amplificação e sequenciamento completo de uma amostra (JA88/20, 15,624 nt, GenBank: MW460905). Interessantemente, a linhagem isolada se separou num ramo e formou um subgenótipo dentro do genótipo América do Sul-I/Europa. No quarto capítulo, as amostras laboratorialmente positivas para o CDV, foram testadas quanto à amplificação dos genes estruturais M (1008 nt), F (1989 nt) e H (1824 nt). Mediante a utilização de novos primers, foi obtido sucesso na amplificação de quatro amostras (4/48). A partir da caracterização molecular destes genes estruturais, foi observada a circulação na região de uma única linhagem durante o período de estudo. Surpreendentemente, os sequenciados revelaram assinaturas moleculares únicas dos isolados no local. O quinto capítulo está relacionado à dinâmica molecular das proteínas M e N, juntamente com o fornecimento de conhecimentos a respeito da geração de drogas antivirais. Os resultados obtidos de dinâmica molecular mostraram que os modelos gerados são de alta qualidade. A partir destes modelos, foi verificado que os resíduos aminoacídicos considerados chave, das proteínas M e N, estão em local acessível, representando assim excelente sítio para a ancoragem de moléculas com potenciais antivirais. Finalmente, no sexto capítulo a proteína M foi expressa em Escherichia coli (BL21) e purificada. Também houve sucesso no emprego da proteína recombinante como substrato no ELISA. Os dados, mostraram que houve acurácia laboratorial na distinção entre amostras IgG anti-CDV positivas e negativas. Em síntese, a proteína recombinante produzida confirma nossa hipótese referente ao seu emprego em ensaios de imunodetecção.Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior (CAPES); Fundação de Apoio à Pesquisa do Distrito Federal (FAP-DF) e Conselho Nacional de Desenvolvimento Científico e Tecnológico (CNPq).Canine distemper virus (CDV), genus Morbillivirus, has emerged and has been recognized as a highly contagious and lethal pathogen in domestic dogs (Canis familiaris). CDV also infects and threatens a wide variety of wild animals, including, for example, the Canidea (wild dogs, fox, wolf, raccoon dog), Mustelidae (ferret, opossum, mink, otter) and Procyonidae families (raccoon, coati). The studies on the CDV are necessary due to the several gaps involving the subject, including prevalence and molecular characterization studies, antiviral therapies and production of laboratory supplies for the diagnosis. Thus, the present study was carried out and consists of six chapters. In the first chapter, a bibliographic review involving the subject in question was carried out. The second chapter refers to the combination of data obtained from the molecular survey, also including data from the literature on molecular and serological detection of the virus in different regions of the world. Although this chapter was published in the form of a meta-analysis, the inclusion of our experimental data in the study stands out, allowing the generation of more robust data regarding the frequency of viral positivity, together with the analysis of several variables potentially involved with the viral infection factor. Still in relation to the second chapter, it is emphasized that it involved the collection of biological samples from dogs with clinical suspicion of distemper, coming from the municipality of Jataí-Goiás. In sum, CDV RNA was detected in 34% (48/141) of dogs suspected to have distemper. These collected samples served as the basis for the realization of chapters three and four. The third chapter involves the complete viral isolation and DNA sequencing. For this purpose, for the first time dozens of primers were developed that allowed the flanking of all genetic material. Thus, there was success in the amplification and complete sequencing of a sample (JA88/2020, 15,624 nt, GenBank: MW460905). Interestingly, the isolated strain separated into a branch and formed a subgenotype within the South America-I/Europe genotype. In the fourth chapter, the laboratory samples positive for CDV, were tested for the amplification of M (1008 nt), F (1989 nt) and H (1824 nt) structural protein genes. Through the use of novel primers, it was successful in amplifying four samples (4/48). From the molecular characterization of structural genes, circulation in the region of a single lineage was observed during the study period. Surprisingly, the sequences reveal unique molecular signatures of the isolates at the site. The fifth chapter is related to the molecular dynamics of M and N proteins, together with the generation of knowledge regarding the rational generation of drugs against CDV. The results obtained from molecular dynamics showed that the models generated are of high quality. From these models, it was verified that the amino acid residues considered key for M and N proteins are in an accessible location, thus representing an excellent site for the anchoring of molecules with potential antivirals. Finally, in the sixth chapter, M protein was expressed in Escherichia coli (BL21), purified. There was also success in the use of recombinant protein as a substrate in the ELISA. The data showed that there was laboratory accuracy in distinguishing between positive and negative anti-CDV IgG samples. In summary, the recombinant protein produced confirms our hypothesis regarding its use in immunodetection assays.Krüger, Ricardo HenriqueMoreli, Marcos LázaroCosta, Vivaldo Gomes da2021-08-18T18:55:15Z2021-08-18T18:55:15Z2021-08-182021-05-19info:eu-repo/semantics/publishedVersioninfo:eu-repo/semantics/doctoralThesisapplication/pdfCOSTA, Vivaldo Gomes da. Isolamento e caracterização molecular do vírus da cinomose canina, análise de antivirais e produção de uma proteína M recombinante. 2021. 152 f., il. Tese (Doutorado em Biotecnologia e Biodiversidade)—Universidade de Brasília, Brasília, Brasília, 2021.https://repositorio.unb.br/handle/10482/41808info:eu-repo/semantics/openAccessporreponame:Repositório Institucional da UnBinstname:Universidade de Brasília (UnB)instacron:UNB2023-07-25T02:25:43Zoai:repositorio.unb.br:10482/41808Repositório InstitucionalPUBhttps://repositorio.unb.br/oai/requestrepositorio@unb.bropendoar:2023-07-25T02:25:43Repositório Institucional da UnB - Universidade de Brasília (UnB)false
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