Obtenção e caracterização estrutural de uma leucil-aminopeptidase de Leptospira interrogans sorovar hordjo expressa em Escherichia coli "BL21-DE3"

Detalhes bibliográficos
Autor(a) principal: Morales Álvares, Alice da Cunha
Data de Publicação: 2010
Tipo de documento: Dissertação
Idioma: por
Título da fonte: Repositório Institucional da UnB
Texto Completo: http://repositorio.unb.br/handle/10482/8027
Resumo: Dissertação (mestrado)—Universidade de Brasília, Instituto de Ciências Biológicas, Departamento de Biologia Celular, 2010.
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spelling Morales Álvares, Alice da CunhaFreitas, Sônia Maria deSantana, Jaime Martins de2011-05-25T01:52:55Z2011-05-25T01:52:55Z2011-05-252010-02-19ÁLVARES, Alice da Cunha Morales. Obtenção e caracterização estrutural de uma leucil-aminopeptidase de Leptospira interrogans sorovar hordjo expressa em Escherichia coli "BL21-DE3". 2010. 157 f., il. Dissertação (Mestrado em Biologia Molecular)-Universidade de Brasília, Brasília, 2010.http://repositorio.unb.br/handle/10482/8027Dissertação (mestrado)—Universidade de Brasília, Instituto de Ciências Biológicas, Departamento de Biologia Celular, 2010.Neste trabalho apresentamos estudo biofísico e estrutural de uma leucil aminopeptidase (LAP), proteína recombinante expressa em Escherichia coli e presente em Leptospira interrogans sorovar Hardjo (LAPr-Li). Essa proteína está diretamente relacionada com a patogenicidade dessa bactéria e com a doença leptospirose em animais e humanos. A LAPr-Li foi obtida por transformação do vetor pET19b-HapepA em E. coli BL21-DE3, expressa a 20ºC, após indução com IPTG 0,3 mM, e purificada por cromatografia de afinidade e de exclusão molecular. Essa enzima apresenta atividade ótima na forma hexamérica em pH 8,5 e temperatura 50ºC. A LAPr-Li é formada por dímeros de trímeros formando o hexâmero, cuja atividade depende desta estrutura. A estrutura secundária é constituída de 44,7% de ?-hélice e 11,6% por folhas-?. A forma hexamérica, de diâmetro 15,2 nm e massa molecular 320 kDa, foi confirmada por ensaios de oligomerização dependentes da temperatura, por espalhamento de luz dinâmico. Estudos de atenuação de fluorescência, utilizando atenuadores carregados e neutros e ajustes de Stern-Volmer, revelaram que a proteína apresenta duas populações de triptofanos. A caracterização dos microambientes foi baseada nas constantes de Stern-Volmer (KSV) obtidas para atenuação com cloreto de césio, apresentou maior acesso aos resíduos de triptofanos, quando comparado ao iodeto de potássio, carregado negativamente. As constantes de atenuação de fluorescência para o césio foram KSV1= 38,6 M-1 e KSV2= 6,4 M-1 e para iodeto KSV1= 4,4 M-1 e KSV2= 0,4M-1. A estabilidade estrutural da LAPr-Li foi analisada a partir de curvas de desnaturação térmica e química obtidas por dicroísmo circular. A elevação da temperatura para 50ºC em pH 8,5 induziu modificações na estrutura secundária e, consequentemente, na conformação da proteína. As curvas de desnaturação térmica (25-95ºC) indicaram maior estabilidade estrutural da LAPr-Li nos pHs 3,0 e 5,0, onde nenhuma alteração estrutural e desnaturação foi observada. Em região alcalina (8,0, 8,5 e 9,0) a LAPr-Li não é desnaturada completamente, resultando, portanto, em valores de ?G25 mais baixos (~2,0 kcal.mol-1) comparados àqueles obtidos nos pHs 6,0 (3,52 kcal.mol-1) e 7,0 (6,63 kcal.mol-1), onde a proteína se desnaturou completamente. Esse último resultado foi confirmado com a curva de desnaturação, utilizando cloridrato de guanidina em água, onde a desnaturação completa da LAPr-Li resultou no valor de ?GH2O de 6,32 kcal. mol-1. _________________________________________________________________________________ ABSTRACTIn this work we present the biophysical studies of the leucine aminopeptidase (LAP), a recombinant protein expressed in Escherichia coli and present in Leptospira interrogans serovar Hardjo (LAPr-Li). This protein is related to pathogenicity of the bacteria and the leptospirosis disease in animals and humans. The LAPr-Li was obtained by transformation of the vector pET19b-HapepA in E. coli BL21-DE3, expressed at 20°C after induction with 0.3 mM IPTG, and purified by affinity and size exclusion chromatography. The enzyme presents optimal activity as hexamer at pH 8.5 and 50°C. LAPr-Li is self assembled as hexamer from trimers of dimmers and its secondary structure consists of 44.7% α-helix and 11.6% for β-sheets. The hexamer with diameter of 15.2 nm and molecular weight 320 kDa was confirmed by dynamic light scattering oligomerization assays. Fluorescence decay studies using charged and neutral quenchers and Stern-Volmer fitting revealed two different populations of tryptophan (exposed and buried) in negatively charged microenvironment. The cesium chloride had greater access to tryptophan residues, when compared to potassium iodide, negatively charged. The constants of fluorescence decay for cesium was KSV1 = 38.6 M-1 and KSV2 = 6.2 M-1 and iodide KSV1 = 4.4 M-1 and KSV2 = 0.4 M-1. The structural stability of LAPr-Li was analyzed from thermal and chemical denaturation curves by circular dichroism spectroscopy. The increase of temperature to 50ºC at pH 8.5 induced secondary structure and conformational changes of the protein. It promotes flexibility of the enzyme that appears to be essential for enzymatic activity. The thermal denaturation curves (25-95ºC) indicated higher structural stability of LAPr-Li at pH 3.0 and 5.0 in which no denaturation profile was observed. At pH 8.0, 8.5 and 9.0 LAPr-Li was partially denatured resulting in lower values of G25 (~ 2.0 kcal.mol-1) compared to those obtained at pH 6.0 (3.52 kcal.mol-1) and 7.0 (6.63 kcal.mol-1), where the protein was completely denatured. The latter result was confirmed by denaturation using aqueous solution of guanidine hydrochloride, where the complete denaturation of LAPr-Li resulted in GH2O value of 6.32 kcal.mol-1.Obtenção e caracterização estrutural de uma leucil-aminopeptidase de Leptospira interrogans sorovar hordjo expressa em Escherichia coli "BL21-DE3"info:eu-repo/semantics/publishedVersioninfo:eu-repo/semantics/masterThesisLeptospiraBiologia molecularBactérias patogênicasProteínasinfo:eu-repo/semantics/openAccessporreponame:Repositório Institucional da UnBinstname:Universidade de Brasília (UnB)instacron:UNBORIGINAL2010_AlicedaCunhaMoralesAlvares.pdf2010_AlicedaCunhaMoralesAlvares.pdfapplication/pdf3239774http://repositorio2.unb.br/jspui/bitstream/10482/8027/1/2010_AlicedaCunhaMoralesAlvares.pdf1a6bf8a22db3e2e23b2651cbe67dc9f1MD51open accessLICENSElicense.txtlicense.txttext/plain1868http://repositorio2.unb.br/jspui/bitstream/10482/8027/2/license.txt618d1ac7cf87d05778ab4461e2c0460dMD52open accessTEXT2010_AlicedaCunhaMoralesAlvares.pdf.txt2010_AlicedaCunhaMoralesAlvares.pdf.txtExtracted texttext/plain235443http://repositorio2.unb.br/jspui/bitstream/10482/8027/3/2010_AlicedaCunhaMoralesAlvares.pdf.txt081103b94900080ee6f9e051b2564dddMD53open access10482/80272023-07-13 17:52:09.727open accessoai:repositorio2.unb.br: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Biblioteca Digital de Teses e DissertaçõesPUBhttps://repositorio.unb.br/oai/requestopendoar:2023-07-13T20:52:09Repositório Institucional da UnB - Universidade de Brasília (UnB)false
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