Método para detecção do RNA viral de SARS-CoV-2 empregando Ribozimas e DNA-hairpins associados em reação de hibridação em cadeia com transferência de energia fluorescente por ressonância

Detalhes bibliográficos
Autor(a) principal: Silva, Leonardo Ferreira da
Data de Publicação: 2023
Tipo de documento: Dissertação
Idioma: por
Título da fonte: Repositório Institucional da UnB
Texto Completo: http://repositorio2.unb.br/jspui/handle/10482/48489
Resumo: Dissertação (mestrado) — Universidade de Brasília, Instituto de Ciências Biológicas, Departamento de Biologia Celular, Programa de Pós-Graduação em Biologia Molecular, 2023.
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spelling Método para detecção do RNA viral de SARS-CoV-2 empregando Ribozimas e DNA-hairpins associados em reação de hibridação em cadeia com transferência de energia fluorescente por ressonânciaSARS-CoV-2RNADiagnósticoDissertação (mestrado) — Universidade de Brasília, Instituto de Ciências Biológicas, Departamento de Biologia Celular, Programa de Pós-Graduação em Biologia Molecular, 2023.A pandemia de COVID-19 teve seu início na província de Wuhan, situada na China, e foi causada pelo coronavírus SARS-CoV-2. Em poucos meses o vírus já tinha se espalhado pelo mundo todo, levando à uma grande preocupação de saúde pública global. Até o presente momento mais de 770 milhões de casos de infecção e mais de 6,9 milhões de óbitos em todo o mundo foram registrados. Esses elevados números de infecção demonstram a importância de métodos diagnósticos capazes de identificar a presença do vírus nos primeiros dias de infecção para direcionar políticas públicas de medidas de contenção evitando sua maior disseminação. Para essa fase inicial o método recomendado é o RT-qPCR, considerado padrão ouro atualmente. Entretanto, essa metodologia apresenta algumas limitações como elevado custo de produção, longo tempo de execução da técnica além da necessidade de mão de obra e equipamentos especializados. Além da necessidade de refrigeração no transporte e armazenamento que limitam sua ampla distribuição e utilização em vários ambientes, principalmente naqueles longe de centros urbanos que não possuem estrutura de saúde pública adequada. Portanto, este estudo tem como objetivo o desenvolvimento de um método diagnóstico sensível e de fácil manuseio, isento de atividade enzimática, de equipamentos e mão de obra especializados e refrigeração. Baseando-se em ribozimas para o reconhecimento e clivagem do RNA viral e moléculas meta-estáveis de grampos de DNA com fluoróforos em suas extremidades, capazes de realizar reação de hibridação em cadeia seguida por transferência ressonante de fluorescência (FRET-HCR) para a identificação do vírus. Os resultados indicaram que duas ribozimas projetadas conseguiram identificar e clivar o alvo transcrito in vitro de RNA viral e as moléculas de DNA hairpin foram eficientes nas reações de HCR e os fluoróforos nas reações de FRET, com os melhores resultados apresentando intensidade de fluorescência 1,34 ± 0,11 vezes superior ao controle negativo, evidenciando assim o potencial do método proposto. Portanto, este estudo serviu como prova de conceito para o uso conjunto de ribozimas e grampos de DNA com fluoróforos em reações FRET-HCR para detectar SARS-CoV-2.The COVID-19 pandemic began in Wuhan province, located in China, and was caused by the SARS-CoV-2 coronavirus. Within a few months, the virus had already spread throughout the world, leading to a major global public health concern. To date, more than 770 million cases of infection and more than 6.9 million deaths have been recorded worldwide. These high infection numbers demonstrate the importance of diagnostic methods capable of identifying the presence of the virus in the first days of infection to guide public policies on containment measures to prevent its further spread. For this initial phase, the recommended method is RT-qPCR, currently considered the gold standard. However, this methodology presents some limitations such as high production cost, need for refrigeration, long execution time of the technique in addition to the need for specialized labor and equipment. Consequently, the need for refrigeration during transport and storage limits its wide distribution and use in various environments, especially those far from urban centers that do not have an adequate public health structure. Therefore, this study aims to develop a sensitive and easy-to-use diagnostic method, free from enzymatic activity, specialized equipment, labor and refrigeration. Relying on ribozymes for the recognition and cleavage of viral RNA and metastable DNA hairpin molecules with fluorophores at their ends, capable of performing hybridization chain reaction followed by fluorescence resonant energy transfer (FRET-HCR) for identification of the virus. The results indicated that two engineered ribozymes were able to identify and cleave the in vitro transcribed target of viral RNA and the DNA hairpin molecules were efficient in HCR reactions and the fluorophores in FRET reactions, with the best results showing fluorescence intensity 1.34 ± 0,11 times higher than the negative control, thus highlighting the potential of the proposed method. Therefore, this study served as a proof of concept for the joint use of ribozymes and DNA hairpin with fluorophores in FRET-HCR reactions to detect SARS-CoV-2.Instituto de Ciências Biológicas (IB)Departamento de Biologia Celular (IB CEL)Programa de Pós-Graduação em Biologia MolecularPereira, Ildinete SilvaCoelho, Cíntia MarquesSilva, Leonardo Ferreira da2024-07-01T19:10:35Z2024-07-01T19:10:35Z2024-07-012023-12-18info:eu-repo/semantics/publishedVersioninfo:eu-repo/semantics/masterThesisapplication/pdfSILVA, Leonardo Ferreira da. Método para detecção do RNA viral de SARS-CoV-2 empregando Ribozimas e DNA-hairpins associados em reação de hibridação em cadeia com transferência de energia fluorescente por ressonância. 2023. 70 f., il. Dissertação (Mestrado em Biologia Molecular) — Universidade de Brasília, Brasília, 2023.http://repositorio2.unb.br/jspui/handle/10482/48489porA concessão da licença deste item refere-se ao termo de autorização impresso assinado pelo autor com as seguintes condições: Na qualidade de titular dos direitos de autor da publicação, autorizo a Universidade de Brasília e o IBICT a disponibilizar por meio dos sites www.unb.br, www.ibict.br, www.ndltd.org sem ressarcimento dos direitos autorais, de acordo com a Lei nº 9610/98, o texto integral da obra supracitada, conforme permissões assinaladas, para fins de leitura, impressão e/ou download, a título de divulgação da produção científica brasileira, a partir desta data.info:eu-repo/semantics/openAccessreponame:Repositório Institucional da UnBinstname:Universidade de Brasília (UnB)instacron:UNB2024-07-01T19:10:36Zoai:repositorio.unb.br:10482/48489Repositório InstitucionalPUBhttps://repositorio.unb.br/oai/requestrepositorio@unb.bropendoar:2024-07-01T19:10:36Repositório Institucional da UnB - Universidade de Brasília (UnB)false
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