Desenvolvimento de uma plataforma de metilação de DNA in vivo para transformação de Clostridium acetobutylicum

Detalhes bibliográficos
Autor(a) principal: Cunha, Catarina Vargas
Data de Publicação: 2019
Tipo de documento: Dissertação
Idioma: por
Título da fonte: Repositório Institucional da UnB
Texto Completo: https://repositorio.unb.br/handle/10482/36999
Resumo: Dissertação (mestrado)—Universidade de Brasília, Departamento de Biologia Celular, Programa de Pós-Graduação em Biologia Molecular, 2019.
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spelling Desenvolvimento de uma plataforma de metilação de DNA in vivo para transformação de Clostridium acetobutylicumClostridium acetobutylicumFermentaçãoClotrídiosDissertação (mestrado)—Universidade de Brasília, Departamento de Biologia Celular, Programa de Pós-Graduação em Biologia Molecular, 2019.Bactérias pertencentes à espécie Clostridium acetobutylicum têm sido amplamente utilizadas para a produção de solventes por realizarem um processo fermentativo conhecido como fermentação ABE (Acetone/Butanol /Ethanol). Através desta via, este micro-organismo é capaz de produzir acetona, butanol e etanol a partir de carboidratos simples. Dessa forma, C. acetobutylicum é considerado um micro-organismo promissor na produção de bioálcoois, sobretudo, de butanol em escala industrial. Diferentes cepas de C. acetobutylicum já foram estudadas e exibiram capacidade de produzir solventes, no entanto, bactérias deste gênero apresentam resistência à manipulação genética decorrente de um sistema endógeno de restrição capaz de clivar sequências de DNA não metilado, impedindo o melhoramento genético desses organismos. O presente estudo teve o objetivo de desenvolver uma cepa de Escherichia coli expressando a metiltransferase φ3Ti-MTP, isolada do fago ϕ3T de Bacillus subtillis, que se mostrou eficiente para a proteção de sequências de DNA contra a ação do sistema de restrição de C. acetobutylicum. Para tanto, foram utilizados como estratégia de edição genômica o sistema CRISPR/Cas9 e o sistema de reparo por HDR (Homology Direct Repair) de E. coli com o objetivo de integrar o gene φ3Ti expressando a metiltransferase no genoma de E. coli. As cepas mutantes foram confirmadas por PCR do fragmento integrado ao DNA genômico de E. coli e a funcionalidade de φ3Ti in vitro foi confirmada pela digestão de vetores previamente introduzidos em células mutadas de E. coli com a enzima SatI, isoesquizômero da enzima de restrição Cac824I, presente no sistema de restrição de C. acetobutylicum. Em seguida a capacidade de metilação e proteção de material plasmidial desses clones foi avaliada in vivo pela transformação de C. acetobutylicum com vetores previamente submetidos aos clones de E. coli. Finalmente, uma técnica de PCR com princípio semelhante ao da TAIL-PCR e o subsequente sequenciamento das regiões amplificadas foram utilizados como estratégia para determinar o local aproximado de integração do gene Φ3Tim. Os resultados obtidos mostraram que o gene φ3Ti foi integrado e expresso com sucesso em E. coli, gerando uma plataforma universal de metilação com a finalidade de permitir a manipulação genética de C. acetobutylicum.Conselho Nacional de Desenvolvimento Científico e Tecnológico (CNPq) e Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior (CAPES).Bacteria belonging to the Clostridium acetobutylicum specie have been widely used for the production of solvents due to their capacity of performing an uncommon fermentative process known as ABE fermentation (Acetone/ Butanol/Ethanol). Through this pathway this microorganism is capable of fermenting simple carbohydrates obtaining as final products the acetone, butanol and ethanol. Thus, C. acetobutylicum is considered promisor for the production of bioalcohols, specially, of butanol in an industrial scale. Different strains of C. acetobutylicum had already been studied and showed capacity of producing solvents; however, bacteria belonging to this genus present resistance to genetic manipulation because of their endogenous restriction system capable of breaking down DNA sequences there are not methylated, hampering the genetic improvement of these organisms. The present study had as objective the development of an Escherichia coli expressing the methyltransferase φ3Ti-MTP, isolated from the ϕ3T phage of Bacillus subtillis, which showed to be efficient for the protection of DNA sequences against the cleavage action of the C. acetobutylicum restriction system. Therefore, the CRISPR/Cas9 system as well as the HDR (Homology Direct Repair) system present in E. coli cells were used as genomic edition strategies for the integration of the gene φ3Ti expressing the methyltransferase in E. coli DH10B genomic DNA. The mutant strains were confirmed by a PCR of the integrated fragment on the E. coli genomic DNA and the functionality in vitro of the φ3Ti gene was confirmed by the digestion of vectors previously introduced in mutant E. coli cells with SatI, an isoschizomer of the Cac824I restriction enzyme, present on the C. acetobutylicum restriction system. Then, the capacity of methylating and protecting plasmidial material of the tested clones was evaluated in vivo through the transformation of C. acetobutylicum with vectors previously subjected to the E. coli clones. Finally, a PCR technique with a principal similar to the one of TAIL-PCR and the subsequent sequencing of the amplified regions were used as strategy to identify the approximate site of integration of the φ3Ti gene. The results obtained showed that the φ3Ti gene was integrated and successfully expressed in E. coli, generating an universal methylation system with the purpose of permitting the genetic manipulation of C. acetobutylicum.Torres, Fernando Araripe GonçalvesCunha, Catarina Vargas2020-02-28T17:05:40Z2020-02-28T17:05:40Z2020-02-282019-07-31info:eu-repo/semantics/publishedVersioninfo:eu-repo/semantics/masterThesisapplication/pdfCUNHA, Catarina Vargas. Desenvolvimento de uma plataforma de metilação de DNA in vivo para transformação de Clostridium acetobutylicum. 2019. vi, 80 f., il. Dissertação (Mestrado em Biologia Molecular)—Universidade de Brasília, Brasília, 2019.https://repositorio.unb.br/handle/10482/36999A concessão da licença deste item refere-se ao termo de autorização impresso assinado pelo autor com as seguintes condições: Na qualidade de titular dos direitos de autor da publicação, autorizo a Universidade de Brasília e o IBICT a disponibilizar por meio dos sites www.bce.unb.br, www.ibict.br, http://hercules.vtls.com/cgi-bin/ndltd/chameleon?lng=pt&skin=ndltd sem ressarcimento dos direitos autorais, de acordo com a Lei nº 9610/98, o texto integral da obra disponibilizada, conforme permissões assinaladas, para fins de leitura, impressão e/ou download, a título de divulgação da produção científica brasileira, a partir desta data.info:eu-repo/semantics/openAccessporreponame:Repositório Institucional da UnBinstname:Universidade de Brasília (UnB)instacron:UNB2023-07-13T20:52:13Zoai:repositorio.unb.br:10482/36999Repositório InstitucionalPUBhttps://repositorio.unb.br/oai/requestrepositorio@unb.bropendoar:2023-07-13T20:52:13Repositório Institucional da UnB - Universidade de Brasília (UnB)false
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