Caracterização do genoma do Papaya lethalyellowing virus e estudo da regulação gênica do Tomato bushy stunt virus

Detalhes bibliográficos
Autor(a) principal: Silva, Ana Maria Rodrigues da
Data de Publicação: 2001
Tipo de documento: Tese
Idioma: por
Título da fonte: Repositório Institucional da UnB
Texto Completo: https://repositorio.unb.br/handle/10482/45537
Resumo: Tese (doutorado) — Univesidade de Brasília, Instituto de Ciências Biológicas, Departamento de Fitopatologia, 2001.
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spelling Caracterização do genoma do Papaya lethalyellowing virus e estudo da regulação gênica do Tomato bushy stunt virusPlantas - doenças e pragasMamão - doenças e pragasVírus de plantas - aspectos genéticosTese (doutorado) — Univesidade de Brasília, Instituto de Ciências Biológicas, Departamento de Fitopatologia, 2001.O presente trabalho teve como objetivo principal obter o seqüenciamento do genoma do Papaya lethal yellowing virus (PLYV) para auxiliar na determinação da posição taxonômica desse vírus. Além disso, o trabalho visou o desenvolvimento de metodologias para o estudo do movimento de vírus em plantas e regulação gênica, sendo escolhido para esse fim, o sistema representado pelo TBSV, que apresenta características semelhantes ao PLYV. Na etapa de caracterização do genoma do PLYV (Capítulo I) foi sequenciado aproximadamente 70 % do genoma viral, representado por uma seqüência contínua de 3226 nucleotídeos. Duas possíveis ORFs principais puderam ser identificadas e foram denominadas ORF POL (provavelmente representando a polimerase viral) e ORF CP (provavelmente representando a proteína do capsídeo do PLYV). A disposição das ORFs e a presença de várias seqüências motivo conservadas, encontradas tanto na polimerase viral quanto na proteína do capsídeo do PLYV, foram as principais características observadas, que levaram a sugerir o PLYV como uma possível espécie pertencente a esse gênero. Entre essas regiões conservadas encontrou-se o motivo GDD (glicina-ácido-aspártico-ácido-aspártico), característico das RNAs polimerases dependentes de RNA que encontrou-se localizado na extremidade carboxil-terminal da polimerase. Além disso, essa seqüência apresentou homologia com as proteínas VPg e serinaprotease dos sobemovírus. Para a proteína VPg foi possível identificar também motivos conservados, como a seqüência consenso WAD (triptofano-alanina-ácido aspártico), seguida de uma região rica em D (ácido aspártico) e E (ácido glutâmico). Essa seqüência de aminoácidos antecede uma seqüência nucleotídica (UUUAAAC) indicadora da mudança de fase do ribossomo (ribossomal frameshift -1). A presença dessa seqüência conservada indica que, provavelmente, o PLYV também codifica a proteína VPg, presente em todos os sobemovírus. Na proteína do capsídeo do PLYV destacou-se a presença do motivo protéico MPYTVGTWLRGVASNWSK, conservado em todos os sobemovírus. Além dessas características moleculares, várias características biológicas como: círculo de hospedeiros restrito, possível transmissão via superfície das sementes e aspectos citopatológicos corroboram o relacionamento mais próximo do PLYV com membros do gênero Sobemovírus. Dados de microscopia eletrônica de transmissão de secções ultrafinas dos tecidos de raiz e folhas de plantas de mamão infectadas pelo PLYV revelaram a presença de grandes quantidades de vírus esféricos no citoplasma e no vacúolo de células infectadas. As partículas virais foram também observadas nos vasos do xilema, mas não nos tubos crivados ou vasos laticíferos. No vacúolo, as partículas de vírus apresentaram-se arranjadas de maneira helicoidal, formando estruturas tubulares. A maioria das hélices mostrou-se composta de cinco partículas por volta. Inclusões do tipo viroplasma, intercaladas com vírions, foram encontradas no citoplasma de algumas células. Partículas do PLYV puderam ser vistas no ápice das células da epiderme das raízes, o que pode explicar a possível transmissão desse vírus pelo solo. A natureza viral dessas partículas toi confirmada por experimentos de imunomarcação com ouro coloidal, usando-se o anti-soro específico anti-PLYV em meio LR-White. Assim, reuniu-se as características citopatológicas do PLYV com aquelas moleculares, para tentativamente sugeri-lo como uma possível espécie pertencente ao gênero Sobemovírus, contrariando as suposições anteriores, que sugeriram que o PLYV seria um tombusvírus. Mesmo assim, a elucidação completa do genoma deve ser concluída para que uma classificação definitiva seja apresentada para o PLYV. No capitulo II, o Tomato bushy stuní virus (TBSV) foi utilizado como um sistema para o estudo do mecanismo de tradução denominado “leaky scanning”. Nesse sistema, o início da tradução ocorre no segundo AUG, ao invés do primeiro códon de iniciação, como é conhecido para os mRNAs de eucariotos. Assim, para que um mRNA seja traduzido por “leaky scanning” o primeiro AUG deve estar sob a influência de um contexto subótimo, apresentar uma seqüência 5 ’ líder não traduzida pequena, ser destituído de estrutura secundária logo após o primeiro códon de iniciação AUG, além de que ambos devem estar relativamente próximos um do outro. O TBSV é um excelente sistema genético para o estudo desses fatores in vivo. A condição na qual duas fases abertas de leitura localizam-se na extremidade 3’ do genoma desse vírus (P19 e P22) e a posição dessas duas ORFs , é um forte indício de que o “leaky scanning” é o que rege a tradução dessas duas proteínas. Utilizando-se mutagênese via PCR e ensaios in vivo, analisou-se a importância da seqüência contexto em tomo do AUG de P22 na acumulação da proteína do capsídeo P41. Os resultados mostrados fortemente sugerem que a acumulação da proteína do capsídeo é afetada negativamente por mutações que redundam em uma seqüência contexto subótima em tomo do códon de iniciação da proteína P22 em relação ao vírus original, que conseqüentemente aumenta a expressão dessa proteína. Da mesma forma, a influência que o comprimento da seqüência líder, que antecede o códon de iniciação da proteína P22, exerce sobre a expressão de P22 e P19 foi analisado. O aumento do comprimento de 16 para 51 nucleotídeos resultou em uma alta taxa de expressão de P22. Porém, não se observou redução nos níveis de expressão de P19. Mesmo assim, os dados apresentados não descartam a hipótese de ser o “leaky scanning” o mecanismo que regula a expressão de proteínas localizadas na extremidade 3’ (P19 e P22) do TBSV.The principal objective of this present work was to obtain the sequence of the Papaya lethal yellowing virus (PLYV) genome to aid in the determination of the taxonomic position of this virus. Also, the work was guided to develop methods for studying virus movement in plants and genetic regulation using TBSV, that presents characteristics similar to PLYV. In the first step of characterization of the PLYV genome (Chapter 1), approximately 70 % of the viral genome was sequenced, represented by a continuos sequence of 3226 nucleotides. Two possible ORFs could be identified and were called ORF POL (representing the putative viral polymerase) and ORF CP (representing the putative PLYV coat protein). The position of the ORFs and the presence of various conserved sequence motifs encountered, not only in the viral polymerase but also the coat protein of PLYV, were the principal characteristics observed that resulted to conclude that PLYV could be species that belongs to this genus. Among these conserved regions, a GDD motif (glycine-aspartate acid-aspartate acid) was found, characteristic of the RNA dependent RNA polymerases that was localized in the extreme carboxyl-terminal of the polymerase. This sequence presented homology with the VPg and serine-protease of sobemovírus. For the VPg protein, it was possible to identify other conserved motifs, such as the WAD (tryptophan-alanine-aspartate acid) consensus sequence, following a region rich in aspartate acid and glutamate acid. This aminoacid sequence was preceded by the ribosomal frameshift nucleotide sequence (UUUAAAC) (ribosomal frameshift -1). The presence o f the conserved sequence indicates that PLYV also codifies the VPg protein, present in ali sobemovírus. In the PLYV coat protein, emphasis should be noted for the protein motif MPYTVGTWLRGVASWSK that is conserved in ali sobemovírus. Besides the molecular characteristics, various biological aspects such as: narrow host range, possible transmission via seed surface and cytopathology, ali point to PLYV being a member of the Sobemovírus genus. Transmission electron microscope data from ultra-thin sections of the roots and leafs of infected papaya by PLYV reveled the presence of large quantities o f spherical virus particles in the cytoplasm and in the vacuole of the infected cells. The virus particles were also observed in the xylem. In the vacuole, the virus particles were arranged in a helical manner, forming tubular structures. The majority of the helices were composed o f five particles per tum. Inclusions of the viroplasm type, intercalated with virions, were found in the cytoplasm of some cells. Particles of PLYV could be seen at the apex of the epidermal cells of the roots, which could explain the possible transmission of this virus through the soil. The nature of these virus particles was confirmed by immunolabel experiments with gold, using antiserum, specifíc anti-PLYV in LR-White resin. Thus, uniting the cytopathological characteristics of PLYV with the molecular, it is suggested as a possible species belonging to the genus Sobemovírus, in contrast to the previous preliminary data that indicated PLYV as a tombusvirus. Even as such, complete elucidation o f the genome should be concluded so that a definitive classification can be made for PLYV. In the second chapter, Tomato bushy stunt virus (TBSV) was used to study the leaky scanning translation mechanism. In this system, the beginning of the translation occurs at the second AUG instead of in the first initiation codon, such as in mRNAs of eukaryotes. So that, in order to be translated by leaky scanning, the first AUG of the mRNA should be under the influence o f a suboptimal context, the mRNA needs to present a 5’ small untranslated leader sequence and lack secondary structure right after the first AUG initiation codon, besides the fact the first AUG should be relatively close to the secong AUG. TBSV is an excellent genetic system to study these factors in vivo. The condition in which the two open reading frames are located at the 3’ end of the genome of this virus (P19 and P22) and the position of the two ORFs provides strong evidence that leaky scanning is what Controls the translation of these two proteins. Using PCR mutagenesis and in vivo assays, the importance of the context sequence around the AUG of P22 in the accumulation of the coat protein P41 was analysed. The results strongly suggested that the accumulation of the coat protein is affected negatively by mutations that surround the suboptimal context sequence around the initiation codon of the P22, in relation to the original virus. This consequently increases the expression of the protein. In the same way, the leader sequence length that is in front of the initiation codon of the P22 protein, that works under the expression o f P22 and P19, was analyzed. An increase in the length from 16 to 51 nucleotides resulted in a higher rate of expression o f P22. But, there was no observation o f a reduction o f the leveis of P19. Even with these results, the data presented does not discard the hypothesis of the leaky scanning mechanism as a regulatory expression model for the localized proteins in the 3 end (P19 and P22) of TBSV.Resende, Renato de OliveiraSilva, Ana Maria Rodrigues da2023-01-20T02:24:19Z2023-01-20T02:24:19Z2023-01-192001info:eu-repo/semantics/publishedVersioninfo:eu-repo/semantics/doctoralThesisapplication/pdfSILVA, Ana Maria Rodrigues da. Caracterização do genoma do Papaya lethalyellowing virus e estudo da regulação gênica do Tomato bushy stunt virus. 2001. viii, 125 f., il. 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