Expressão de proteínas do vírus da Dengue em células de inseto utilizando o Sistema Baculovírus de Expressão

Detalhes bibliográficos
Autor(a) principal: Barros, Maria Creuza do Espírito Santo
Data de Publicação: 2007
Tipo de documento: Dissertação
Idioma: por
Título da fonte: Repositório Institucional da UnB
Texto Completo: http://repositorio.unb.br/handle/10482/2971
Resumo: Dissertação (mestrado)—Universidade de Brasília, Faculdade de Medicina, 2007.
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Essa doença é causada por um vírus de RNA fita simples, senso positivo e envelopado que pertence ao gênero Flavivirus, onde o genoma é organizado em uma única fase aberta de leitura (ORF), que codifica três proteínas estruturais (capsídeo, pré- M e envelope) e sete proteínas não-estruturais (NS1, NS2a, NS2b, NS3, NS4a, NS4b, NS5). Entre as proteínas virais, a proteína do envelope é uma das mais antigênicas e a proteína NS1 está relacionada com a lise de células infectadas, mediada pelo sistema complemento. Diferentes sistemas de expressão podem ser usados para a expressão de antígenos virais para o desenvolvimento de vacinas e/ou diagnóstico. Entre estes sistemas, o sistema de expressão baseado em baculovírus (BEV) é um dos mais populares e eficientes. Baculovírus infectam artrópodes, principalmente insetos e possuem um genoma de DNA circular, dupla fita. Existem muitas vantagens do BEV em relação a outros sistemas de expressão, como, por exemplo, o alto nível de expressão e as modificações pós-traducionais que permitem a montagem correta e atividade biológica da proteína expressa. Um isolado brasileiro de Dengue virus 1 foi usado para amplificar o gene do envelope ou o gene do envelope fusionado ao gene NS1 por RT-PCR, usando oligonucleotídeos específicos e os fragmentos obtidos foram clonados no vetor de transferência comercial pFastBac1 (Invitrogen). Esse plasmídeo possui regiões sítio-específicas que permitam a transposição do inserto de interesse dentro do genoma de um baculovírus (bacmídeo) propagado em Escherichia coli. O bacmídeo recombinante é usado para a expressão da proteína heteróloga em células de inseto infectadas. Dois vírus recombinantes foram obtidos, vAcDE e vAcDENS1, que expressão e as modificações pós-traducionais que permitem a montagem correta e atividade biológica da proteína expressa. Um isolado brasileiro de Dengue virus 1 foi usado para amplificar o gene do envelope ou o gene do envelope fusionado ao gene NS1 por RT-PCR, usando oligonucleotídeos específicos e os fragmentos obtidos foram clonados no vetor de transferência comercial pFastBac1 (Invitrogen). Esse plasmídeo possui regiões sítio-específicas que permitam a transposição do inserto de interesse dentro do genoma de um baculovírus (bacmídeo) propagado em Escherichia coli. O bacmídeo recombinante é usado para a expressão da proteína heteróloga em células de inseto infectadas. Dois vírus recombinantes foram obtidos, vAcDE e vAcDENS1, que foram, então, usados para infectar larvas de Spodoptera frugiperda. Extratos de tecido adiposo de larvas infectadas (96 h.p.i.) foram analisadas por SDS-PAGE e Western- blot, usando um anticorpo contra o vírus do dengue, que detectou um polipeptídeo por volta de 70 kDa em ambos os extratos. Esse polipeptídeo é diferente do tamanho predito da proteína do envelope (~50 kDa) e das proteínas do envelope mais NS1 fusionadas (~90kDa). Entretanto, a análise transcricional confirmou que os genes estavam sendo transcritos em células infectadas. Nós também usamos o virus vAcDENS1 em um ensaio de fusão de membrana e confirmamos a formação de sincício dependente de pH, o que é uma característica da proteína do envelope do vírus do dengue. O gene NS1 foi também clonado em um plasmídeo, sob o comando do promotor hsp70 de Drosophila melanogaster e usado em uma co-transfecção com um plasmídeo contendo um gene de resistência à puromicina, visando a construção de células de inseto estavelmente transformadas. _______________________________________________________________________________ ABSTRACTDengue is the most common mosquito-borne viral disease of humans and its infection may evolve to a potentially lethal disease known as Dengue haemorrhagic fever (DHF). This disease is caused by a positive-sense, single-stranded, enveloped RNA virus that belongs to the genus Flavivirus within Flaviviridae and its genome is organized in a single ORF which encodes three structural proteins (capsid, pre-M, and envelope) and seven non-structural proteins (NS1, NS2a, NS12b, NS3, NS4a, NS4b, NS5). Among the viral proteins, the envelope protein is one of the most antigenic and NS1 play a possible role in complement-mediated cytolysis. Different heterologous expression systems may be used for the expression of viral antigens for vaccine and/or diagnosis development. Among these, the Baculovirus Expression System (BEV) is one of the most popular and efficient system. Baculoviruses have a circular, double stranded DNA genome and infect arthropodes, mainly insects. There are many advantages of using BEV, when compared to other expression systems, such as high expression levels and post-translational modifications that allows the expressed proteins to be correctly folded and biologically active. A Brazilian Dengue 1 isolate was used to amplify the envelope gene alone or envelope plus NS1 gene by RT-PCR using specific oligonucleotides and cloned into the commercial transfer vector pFastBac1 (Invitrogen). This plasmid has site-specific regions which allows transposition of the chosen insert into a baculovirus genome (bacmid) propagated in Escherichia coli. The recombinant bacmid DNA is used to obtain recombinant baculovirus and heterologous protein expression in virus-infected insect cells. Two different recombinant virus were obtained, vAcDE and vAcDENS1, and they were used to infect Spodoptera frugiperda larvae. Fat body extracts of infected larvae (96 h p.i.) were analysed by SDS-PAGE and Western blot using an anti-Dengue antibody which detected a polypeptide around 70 kDa in both extracts. The size of this polypetide is different from the predicted size of the envelope protein (~50 kDa) and the fused envelope and NS1 proteins (~90kDa). However, transcriptional analysis confirmed that the genes were being transcribed in infected cells. We also used the vAcDENS1 virus in a membrane fusion assay and confirmed pH-dependent syncytium formation, which is a characteristic of the dengue virus envelope protein.. The NS1 gene alone was cloned under the control of hsp70 promoter and used to co-transfect insect cells with a plasmid containing the puromycin resistance gene, in order to produce stably transformed insect cells.Faculdade de Medicina (FMD)Programa de Pós-Graduação em Patologia MolecularExpressão de proteínas do vírus da Dengue em células de inseto utilizando o Sistema Baculovírus de Expressãoinfo:eu-repo/semantics/publishedVersioninfo:eu-repo/semantics/masterThesisDengueBaculovirosesDoenças transmissíveisBRAinfo:eu-repo/semantics/openAccessporreponame:Repositório Institucional da UnBinstname:Universidade de Brasília (UnB)instacron:UNBORIGINAL2007_MariaCreuzadoEspiritoSantoBarros.PDF2007_MariaCreuzadoEspiritoSantoBarros.PDFapplication/pdf2427022http://repositorio2.unb.br/jspui/bitstream/10482/2971/1/2007_MariaCreuzadoEspiritoSantoBarros.PDFc1b6ff19e770ca676614dcd850cdc8f6MD51open accessLICENSElicense.txtlicense.txttext/plain1863http://repositorio2.unb.br/jspui/bitstream/10482/2971/2/license.txtf39e86334773ec7094da438678cd4b9aMD52open accessTEXT2007_MariaCreuzadoEspiritoSantoBarros.PDF.txt2007_MariaCreuzadoEspiritoSantoBarros.PDF.txtExtracted texttext/plain163858http://repositorio2.unb.br/jspui/bitstream/10482/2971/3/2007_MariaCreuzadoEspiritoSantoBarros.PDF.txteec9006381b3b4fc09a185fb34e909b2MD53open access10482/29712024-02-29 10:22:30.864open accessoai:repositorio2.unb.br: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 Digital de Teses e DissertaçõesPUBhttps://repositorio.unb.br/oai/requestopendoar:2024-02-29T13:22:30Repositório Institucional da UnB - Universidade de Brasília (UnB)false
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