Estratégias para investigação do efeito do gene LMX1B na síndrome de unha patela : CRISPR-Cas9 e diferenciação condrogênica

Detalhes bibliográficos
Autor(a) principal: Ribeiro, Júlia Hellena Mendes
Data de Publicação: 2024
Tipo de documento: Dissertação
Idioma: por
Título da fonte: Repositório Institucional da UnB
Texto Completo: http://repositorio.unb.br/handle/10482/50283
Resumo: Dissertação (mestrado) — Universidade de Brasília, Faculdade de Medicina, Programa de Pós-Graduação em Patologia Molecular, 2024.
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spelling Estratégias para investigação do efeito do gene LMX1B na síndrome de unha patela : CRISPR-Cas9 e diferenciação condrogênicaCRISPR-Cas9Genética - manipulaçãoSíndrome de unha-patelaCélulas-troncoDissertação (mestrado) — Universidade de Brasília, Faculdade de Medicina, Programa de Pós-Graduação em Patologia Molecular, 2024.As doenças genéticas esqueléticas são um conjunto de doenças que podem afetar desde os ossos até os tecidos, possuindo uma manifestação clínica muito variável; são majoritariamente incuráveis e dependem de tratamentos paliativos. A Síndrome de Nail-Patella (NPS; OMIM: 161200) é uma anomalia autossômica dominante causada por mutações em heterozigose no gene LMX1B, e apesar de possuir sinais clínicos bem descritos pouco se compreende sobre seus mecanismos moleculares. Este projeto teve como objetivo principal o desenvolvimento de ferramentas para estudo da NPS usando CRISPR-Cas9 e condrogênese. Devido à expressão precoce do gene durante a embriogênese, células-tronco de pluripotência induzida (iPSC) foram inicialmente escolhidas para o projeto, visando sua edição por meio do sistema CRISPRCas9. No entanto, devido à complexidade dos custos associados à cultura de iPSC, células estromais mesenquimais (CEM) e células renais embrionárias (HEK293T) foram escolhidas como alternativa. Testes com plasmídeos de fluorescência utilizando Lipofectamine™ e Nucleofector™ demonstraram que tanto as iPSC como as CEM foram viáveis para a entrega de plasmídeos, apesar da taxa de transfecção inferior à literatura. A inserção dos plasmídeos com sgRNA aumentou a mortalidade celular, bem como a inserção da puromicina para a seleção dos clones, dessa forma levanta-se a possibilidade da deleção do gene ser letal para as células. Concomitantemente foi realizada a otimização da diferenciação condrogênica de células iPS, facilitando o estudo de doenças genéticas do esqueleto a partir de células pluripotentes. No tocante à expressão gênica, observou-se que durante a condrogênese o gene SOX9, iniciador da condrogênese, apresenta o mesmo perfil de LMX1B, sugerindo sua associação. Para análise do perfil de expressão do gene em células renais utilizou-se as HEK293T Cas9 estáveis e resistentes à puromicina, coletando-se seu material após transfecção com sgRNA de interesse e analisando perturbações no genoma. Este projeto possibilitou a definição de protocolos para transfecção de iPSC e CEM, bem como HEK293T, demonstrando seu potencial de inserção de plasmídeos. Além disso foi definido também um novo protocolo para diferenciação condrogênica de iPSC e dados de qPCR evidenciaram ligação entre a expressão de SOX9 e LMX1B, esses achados abrem portas para o estudo de doenças genéticas do esqueleto em sistemas in vitro utilizando diferentes estratégias de entrega do CRISPR-Cas9.Skeletal genetic diseases are a group of conditions that can affect bones and tissues, exhibiting a highly variable clinical manifestation. These diseases are predominantly incurable and rely on palliative treatments. Nail-Patella Syndrome (NPS; OMIM: 161200) is an autosomal dominant anomaly caused by heterozygosity mutations in the LMX1B gene. Despite welldescribed clinical signs, little is understood about its molecular mechanisms. Due to the gene's early expression during embryogenesis, induced pluripotent stem cells (iPSC) were initially chosen for the project, aiming for CRISPR-Cas9-mediated gene editing. However, due to the complex and costly nature of iPSC culture, mesenchymal stem cells (MSC) and embryonic kidney cells (HEK293T) were chosen as alternatives. Fluorescent plasmid tests using Lipofectamine™ and Nucleofector™ demonstrated that both iPSC and MSC were viable for delivery, although the transfection rate was lower than reported in the literature. Plasmid insertion with sgRNA increased cell mortality, as did puromycin insertion for clone selection, raising the possibility that gene deletion might be lethal for cells. Simultaneously, optimization of iPSC chondrogenic differentiation was performed, facilitating the study of genetic skeletal diseases from pluripotent cells. Regarding gene expression, it was observed that during chondrogenesis, the SOX9 gene, an initiator of chondrogenesis, exhibited a similar profile to LMX1B, suggesting their association. For gene expression analysis in renal cells, stable HEK293T Cas9 cells resistant to puromycin were used, collecting their material after transfection using sgRNA of interest and analyzing genome disturbances. This project enabled the establishment of protocols for the transfection of iPSC and CEM, as well as HEK293T, demonstrating their potential for plasmid insertion. Additionally, a new protocol for chondrogenic differentiation of iPSC was also defined, and qPCR data revealed a connection between the expression of SOX9 and LMX1B, these findings open new doors for the study of skeletal genetic diseases using in vitro systems with different strategies of delivery of the CRISPR-Cas9 system.Faculdade de Medicina (FMD)Programa de Pós-Graduação em Patologia MolecularFelipe, Maria Sueli SoaresPogue, Robert E.Ribeiro, Júlia Hellena Mendes2024-09-03T19:50:08Z2024-09-03T19:50:08Z2024-09-032024-01-22info:eu-repo/semantics/publishedVersioninfo:eu-repo/semantics/masterThesisapplication/pdfRIBEIRO, Júlia Hellena Mendes. Estratégias para investigação do efeito do gene LMX1B na síndrome de unha patela: CRISPR-Cas9 e diferenciação condrogênica. 2024. 120 f., il. Dissertação (Mestrado em Patologia Molecular) — Universidade de Brasília, Brasília, Brasília, 2024.http://repositorio.unb.br/handle/10482/50283porA concessão da licença deste item refere-se ao termo de autorização impresso assinado pelo autor com as seguintes condições: Na qualidade de titular dos direitos de autor da publicação, autorizo a Universidade de Brasília e o IBICT a disponibilizar por meio dos sites www.unb.br, www.ibict.br, www.ndltd.org sem ressarcimento dos direitos autorais, de acordo com a Lei nº 9610/98, o texto integral da obra supracitada, conforme permissões assinaladas, para fins de leitura, impressão e/ou download, a título de divulgação da produção científica brasileira, a partir desta data.info:eu-repo/semantics/openAccessreponame:Repositório Institucional da UnBinstname:Universidade de Brasília (UnB)instacron:UNB2024-09-03T19:50:08Zoai:repositorio.unb.br:10482/50283Repositório InstitucionalPUBhttps://repositorio.unb.br/oai/requestrepositorio@unb.bropendoar:2024-09-03T19:50:08Repositório Institucional da UnB - Universidade de Brasília (UnB)false
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