Análise in sílico e produção da apirase recombinante de Rhodnius Prolixus

Detalhes bibliográficos
Autor(a) principal: Moura, Renan Pereira
Data de Publicação: 2024
Tipo de documento: Dissertação
Idioma: por
Título da fonte: Repositório Institucional da UnB
Texto Completo: http://repositorio2.unb.br/jspui/handle/10482/50058
Resumo: Dissertação (mestrado) — Universidade de Brasília, Faculdade de Medicina, Programa de Pós-Graduação em Ciências Médicas, 2023.
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spelling Análise in sílico e produção da apirase recombinante de Rhodnius ProlixusTriatomíneosDoença de ChagasNucleotídeosBioinformáticaDissertação (mestrado) — Universidade de Brasília, Faculdade de Medicina, Programa de Pós-Graduação em Ciências Médicas, 2023.A Doença de Chagas (DC) é causada pelo protozoário flagelado Trypanosoma cruzique é transmitido entre hospedeiros por triatomíneos (Hemiptera: Reduviidae). A DC é uma doença negligenciada e endêmica nas Américas. Na saliva de triatomíneos são encontradas moléculas que contrapõem a hemostasia e modulam o sistema imune do hospedeiro. As apirases são moléculas que catabolizam nucleotídeos e nucleosídeos e interferem na agregação plaquetária mediada por ADP. Rhodnius prolixus é um importante vetor/transmissor da DC. Os objetivos deste estudo foram realizar uma análise in sílico das apirases de R. prolixus e produzir as proteínas recombinantes em sistema heterólogo de expressão procarioto. Duas sequências deapirases de R. prolixus (T1H8D6 e T1H852) foram caracterizadas in sílico, clonadas no vetor de expressão Pet17b (Novagen) e fusionadas com cauda 6xHis para expressão em sistema bacteriano utilizando a linhagem de bactérias Escherichia coliBL21(DE3). Após a transformação, seleção e cultivo dos clones bacterianos, SDS-PAGE e Western blotting foram realizados para confirmar a expressão das apirases recombinantes de R. prolixus. A atividade apirásica foi avaliada em solução e por zimografia. Das duas apirases de R. prolixus, apenas a proteína T1H8D6 de aproximadamente 40 kDa foi expressa. A proteína recombinante foi observada somente na fração insolúvel sob a forma de agregados celulares, formando corpos de inclu são. Os corpos de inclusão foram preparados e purificados por cromatografia de afinidade. As sequências de aminoácidos das apirases de R. prolixus possuem sítios para N-glicosilação, O-glicosilação, acetilação, fosforilação e presença de um peptí deo sinal. Além disso, a análise comparativa entre os modelos das apirases de R. prolixus com membros das famílias CD39, 5’ nucleotidase e Cimex mostrou que elas possuem similaridade com a família Cimex, as quais são dependentes de Ca2+ para a sua atividade no catabolismo de nucleotídeos. As apirases facilitam a hematofagia através da inibição da agregação plaquetária mediada por ADP no hospedeiro vertebrado e seu estudo pode auxiliar no desenvolvimento de abordagens para prevenir a transmissão da DC.Chagas Disease (CD) is caused by the flagellated protozoan Trypanosoma cruzi, which is transmitted among hosts by triatomines (Hemiptera: Reduviidae). CD is a neglected and endemic disease in the Americas. In the saliva of triatomines, mole cules are found that counteract hemostasis and modulate the host's immune system. Apyrases are molecules that catabolize nucleotides and nucleosides and interfere with ADP-mediated platelet aggregation. Rhodnius prolixus is an important vec tor/transmitter of CD. The objectives of this study were to perform an in-silico analysis of R. prolixus apyrases and to produce recombinant proteins in a heterologous pro karyotic expression system. Two sequences of R. prolixus apyrases (T1H8D6 and T1H852) were characterized in silico, cloned into the expression vector pET17b (No vagen), and fused with a 6xHis tag for expression in a bacterial system using the Escherichia coli BL21(DE3) strain. After transformation, selection, and cultivation of bacterial clones, SDS-PAGE and Western blotting were performed to confirm the ex pression of recombinant R. prolixus apyrases. Apyrase activity was evaluated in solu tion and by zymography. Of the two R. prolixus apyrases, only the T1H8D6 protein of approximately 40 kDa was expressed. The recombinant protein was observed in the insoluble fraction as cellular aggregates, forming inclusion bodies that were prepared and purified by affinity chromatography. The amino acid sequences of R. prolixus ap yrases have sites for N-glycosylation, O-glycosylation, acetylation, phosphorylation, and the presence of a signal peptide. Furthermore, comparative analysis between the models of R. prolixus apyrases and members of the CD39, 5' nucleotidase, and Cimex families showed that they are similar to the Cimex family, which are dependent on Ca2+ their activity on nucleotides. Apyrases facilitate hematophagy by inhibiting ADP-mediated platelet aggregation in the vertebrate host, and their study may help in the development of approaches to prevent the transmission of CD.Faculdade de Medicina (FM)Programa de Pós-Graduação em Ciências MédicasSantana, Jaime Martins deMoura, Renan Pereira2024-08-20T21:45:20Z2024-08-20T21:45:20Z2024-08-202024-04-26info:eu-repo/semantics/publishedVersioninfo:eu-repo/semantics/masterThesisapplication/pdfRenan Pereira Moura. Análise in sílico e produção da apirase recombinante de Rhodnius Prolixus. 2023. 77 f., il. Dissertação (Mestrado em Ciências Médicas) — Universidade de Brasília, Brasília, 2023.http://repositorio2.unb.br/jspui/handle/10482/50058porinfo:eu-repo/semantics/openAccessreponame:Repositório Institucional da UnBinstname:Universidade de Brasília (UnB)instacron:UNB2024-09-19T15:36:28Zoai:repositorio.unb.br:10482/50058Repositório InstitucionalPUBhttps://repositorio.unb.br/oai/requestrepositorio@unb.bropendoar:2024-09-19T15:36:28Repositório Institucional da UnB - Universidade de Brasília (UnB)false
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