Caracterização morfofisiológica de espermatozoides do epidídimo e estabelecimento de protocolo para seu uso na produção in vitro de embriões bovinos

Detalhes bibliográficos
Autor(a) principal: Cunha, Andrielle Thainar Mendes
Data de Publicação: 2019
Tipo de documento: Tese
Idioma: por
Título da fonte: Repositório Institucional da UnB
Texto Completo: http://repositorio.unb.br/handle/10482/35756
Resumo: Tese (doutorado)—Universidade de Brasília, Instituto de Ciências Biológicas, Programa de Pós-Graduação em Biologia Animal, 2019.
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spelling Caracterização morfofisiológica de espermatozoides do epidídimo e estabelecimento de protocolo para seu uso na produção in vitro de embriões bovinosEspermatozoides da cauda do epidídimo (EP)Produção in vitro de embriões (PIVE)Sêmen bovinoHeparinaTese (doutorado)—Universidade de Brasília, Instituto de Ciências Biológicas, Programa de Pós-Graduação em Biologia Animal, 2019.A recuperação de espermatozoides da cauda do epidídimo (EP) permite o uso de gametas que seriam perdidos devido a morte ou falhas na capacidade reprodutiva de animais. Os EP diferem dos espermatozoides do ejaculado (EJ) por não serem expostos ao plasma seminal, essas diferenças fisiológicas podem interferir em fatores como a longevidade, vias de capacitação e potencial de fecundação. Portanto para que se possa estabelecer os procedimentos mais adequados para o uso eficiente de EP na produção in vitro de embriões (PIVE), melhor conhecimento sobre seu comportamento morfofisiológico é necessário. O presente estudo objetivou identificar o comportamento fisiológico de EP durante o processo de PIVE, estabelecer melhorias no protocolo de PIVE ao utilizar EP e, caracterizar morfologicamente os EP. EP e EJ foram coletados de sete touros Gir e utilizados em cinco experimentos. No Experimento 1 foi avaliado o efeito da suplementação com heparina (EP+) na longevidade e viabilidade espermática, e no experimento 2 a influência da heparina nas taxas de fecundação (TF). No experimento 3, dois gradientes descontínuos (Percoll e PureSperm) foram testados na PIVE, e sua influência no sexo dos embriões foi avaliada. O experimento 4 foi realizado para avaliar o tempo necessário que EP precisam para atingir o máximo de ovócitos fecundados, para isto, diferentes tempos de co-incubação (3, 6, 12 e 18h) foram propostos. Por fim, no experimento 5 foi realizada a caracterização morfológica de EP utilizando a microscopia de força atômica (MFA). Os dados obtidos nos experimentos 1 e 5 foram submetidos à análise de variância (ANOVA) seguido de comparação múltipla de Tukey-Kramer (P≤0,05), além disso uma análise dos componentes principais foi realizada no experimento 5. Os resultados da TF e produção embrionária foram analisados pelo Qui-quadrado (P≤0,05) e a sexagem embrionária pelo teste de Wilcoxon (P≤0,05). Os experimentos 1 e 2 mostraram que a heparina afetou a viabilidade, longevidade e o tempo necessário para EP fecundar os ovócitos. Após 6h, o grupo EP+ já havia fecundado 82% dos ovócitos, sendo superior aos grupos EJ (19%) e EP (42%). Às 12 e 18h, a TF permaneceu mais alta no grupo EP+, e um aumento gradual na polispermia foi observado. No Experimento 3, o uso de gradientes para a seleção espermática de EP apresentou maior produção embrionária (Percoll 54%; PureSperm 52%) do que o observado no método de lavagem (37%), após sete dias de cultivo embrionário. Os embriões produzidos por EP selecionados em gradiente resultaram e um desvio de sexo em favor de embriões machos. Em relação ao tempo necessário para co-incubação analisado no experimento 4, não foram observadas diferenças entre os grupos. Os dados obtidos na MFA, experimento 5, mostraram que as dimensões uni, bi e tri dimensionais não diferiram entre os grupos EP e EJ. Entretanto, os descritores de forma mostram que o grupo EP apresentou maior rugosidade e elongamento, e menor fator de forma e taxa de circularidade. Concluindo, ao utilizar EP o tempo de fecundação in vitro pode ser reduzido para 6h sem afetar a produção e qualidade do embrião, a seleção espermática do EP pode ser realizada utilizando Percoll ou PureSperm, no entanto, um desvio de sexo nos embriões produzido foi observado. Quanto às características morfológicas, EP e EJ coletados dos mesmos reprodutores são morfologicamente semelhantes em 19 dos 24 parâmetros avaliados, indicando que ausência de plasma seminal não afeta a morfologia de EP.Conselho Nacional de Desenvolvimento Científico e Tecnológico (CNPq); Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior (CAPES); Fundação de Apoio à Pesquisa do Distrito Federal (FAP-DF) e Embrapa Recursos Genéticos e Biotecnologia.The recovery of sperm from the epididymis tail (EP) allows the use of gametes that would be lost due to death or failures in the reproductive capacity of animals. EP differ from ejaculate spermatozoa (EJ) because they are not exposed to seminal plasma, these physiological differences can affect factors such as longevity, pathways of capacitation and fertilization potential. Therefore, in order to establish the most appropriate procedures for the efficient use of EP in the in vitro production of embryos (IVEP), better knowledge about its morphological and physiological behavior is necessary. The present study aimed to identify the physiological behavior of EP during the IVEP process, to can establish improvements in their protocol when EP is using, and to characterize the morphologically of the EP. EP and EJ were recovery from seven Gir bulls and used in five experiments. Experiment 1: the effect of heparin supplementation (EP+) on longevity and sperm viability was evaluated, after which the influence of heparin on fertilization rates (FR) was tested (experiment 2). In experiment 3, two discontinuous gradients (Percoll and PureSperm) were tested in IVEP, and their influence on the sex of the embryos was evaluated. Experiment 4 the time needed for EP to reach the maximum number of fertilized oocytes was evaluated, different co-incubation times (3, 6, 12, and 18h) were proposed. Finally, for the morphological characterization of EP using atomic force microscopy (AFM), experiment 5 was developed. Thus, with the objective of establishing improvements in the IVEP protocol using EP, physiological differences in the behavior of EP during the IVEP process and their morphological characterization were evaluated. The data obtained in experiments 1 and 5 were submitted to an analysis of variance (ANOVA) followed by Tukey-Kramer multiple comparison (P≤0.05) and a principal component analysis was made for the results of experiment 5. The results of the FR rate and embryo production were analyzed by the Chi-square test (P≤0.05) and the embryo sex was analyzed through the Wilcoxon test (P≤0.05). Experiments 1 and 2 showed that heparin affected the viability, longevity, and time required for EP fertilize oocytes. After 6h, the EP+ group had fertilized 82% of the oocytes, being superior to the EJ (19%) and EP (42%). At 12 and 18h, FR remained higher in the EP+, and a gradual increase in polyspermy was observed. Experiment 3: the use of gradients for the selection of EP showed higher embryo production (Percoll 54%; PureSperm 52%) than that observed in the washing method (37%) after seven days of embryo culture. Embryos produced using EP selected in gradients resulted in a gender deviation in favor of male embryos. Regarding the time required for co-incubation analyzed in experiment 4, no differences were observed between the groups. The data obtained in the AFM analysis in experiment 5 showed that the one, two and three dimensional measurements did not show differences between the EP and EJ groups. However, the shape descriptors show that the EP group presented higher roughness and elongation, and lower form factor and circularity rate. In conclusion, in vitro fertilization time can be reduced to 6h without affecting embryo production and quality, the spermatic selection of EP can be performed using Percoll or PureSperm; however, a gender deviation in the produced embryos was observed. Concerning the morphological characteristics observed, EP and EJ collected from the same sire presented similar morphological characteristics in 19 of the 24 parameters evaluated, indicating that absence of seminal plasma does not affect the morphology of EP.Instituto de Ciências Biológicas (IB)Programa de Pós-Graduação em Biologia AnimalDode, Margot Alves NunesCunha, Andrielle Thainar Mendes2019-11-05T22:13:30Z2019-11-05T22:13:30Z2019-11-052019-04-12info:eu-repo/semantics/publishedVersioninfo:eu-repo/semantics/doctoralThesisapplication/pdfCUNHA, Andrielle Thainar Mendes. Caracterização morfofisiológica de espermatozoides do epidídimo e estabelecimento de protocolo para seu uso na produção in vitro de embriões bovinos. 2019. xiii, 101 f., il. Tese (Doutorado em Biologia Animal)—Universidade de Brasília, Brasília, 2019.http://repositorio.unb.br/handle/10482/35756InglêsporA concessão da licença deste item refere-se ao termo de autorização impresso assinado pelo autor com as seguintes condições:Na qualidade de titular dos direitos de autor da publicação, autorizo a Universidade de Brasília e o IBICT a disponibilizar por meio dos sites www.bce.unb.br, www.ibict.br, http://hercules.vtls.com/cgi-bin/ndltd/chameleon?lng=pt&skin=ndltd sem ressarcimento dos direitos autorais, de acordo com a Lei nº 9610/98, o texto integral da obra disponibilizada, conforme permissões assinaladas, para fins de leitura, impressão e/ou download, a título de divulgação da produção científica brasileira, a partir desta data.info:eu-repo/semantics/openAccessreponame:Repositório Institucional da UnBinstname:Universidade de Brasília (UnB)instacron:UNB2024-01-31T17:27:20Zoai:repositorio.unb.br:10482/35756Repositório InstitucionalPUBhttps://repositorio.unb.br/oai/requestrepositorio@unb.bropendoar:2024-01-31T17:27:20Repositório Institucional da UnB - Universidade de Brasília (UnB)false
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