Transformação de trichoderma harzianum BRM27158 por agrobacterium tumefaciens e caracterização de uma biblioteca de transformantes

Detalhes bibliográficos
Autor(a) principal: Tamietti, Mariana Santos
Data de Publicação: 2018
Tipo de documento: Dissertação
Idioma: por
Título da fonte: Repositório Institucional da UnB
Texto Completo: http://repositorio.unb.br/handle/10482/34471
Resumo: Dissertação (mestrado)—Universidade de Brasília, Departamento de Biologia Celular, Programa de Pós-Graduação em Biologia Molecular, 2018.
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spelling Transformação de trichoderma harzianum BRM27158 por agrobacterium tumefaciens e caracterização de uma biblioteca de transformantesTrichoderma harzianum BRM27158 Agrobacterium tumefaciens mediated transformation and characterization of a transformants libraryMelhoramento genéticoFungos - genéticaFungos como agentes no controle biológico de pragasGenética molecularDissertação (mestrado)—Universidade de Brasília, Departamento de Biologia Celular, Programa de Pós-Graduação em Biologia Molecular, 2018.Fungos do gênero Trichoderma são conhecidos agentes de controle biológico. Os mecanismos envolvidos em tal atividade abrangem as interações entre a tríade patógeno-antagonista-planta, num processo complexo e integrado que, além de proteger a planta, promove seu crescimento. Neste trabalho, buscou-se identificar possíveis genes alvo para melhoramento genético de Trichoderma harzianum. Para tanto, foi construída uma biblioteca de transformantes de T. harzianum BRM27158, por transformação mediada por A. tumefaciens, tendo o plasmídeo pFAT-gfp como vetor binário e gerando inserções aleatórias do T-DNA contendo os genes hph (marcador seletivo) e gfp (gene repórter). A biblioteca foi purificada por cultivo monospórico e submetida a uma triagem preliminar, da qual 10 linhagens foram selecionadas para este estudo. Todos os agrotransformantes selecionados exibiram estabilidade genética, mantendo o fenótipo de resistência à higromicina B após 6 gerações. A confirmação molecular da inserção do T-DNA se deu por amplificação dos genes hph e gfp com primers específicos. Os 10 fungos e o selvagem foram caracterizados quanto à produção de proteases em cultivo submerso e em meio sólido. Das dez linhagens, quatro (T25, T40, T113 e T136) apresentaram diminuição de crescimento em substratos proteicos. Além disso, os transformantes T40, T50 e T113 apresentaram acentuada redução da capacidade de inibir a bactéria Staphylococcus aureus, em comparação com o fungo selvagem. As regiões flanqueadoras do T-DNA de cada transformante selecionado foram recuperadas por TAIL-PCR, clonadas, sequenciadas e comparadas aos bancos de dados NCBI e JGI e ao genoma anotado de BRM27158. Foi identificada uma inserção num gene que codifica uma provável NRPS (peptídeo sintase não ribossômica), envolvida na produção de compostos secundários. A caracterização fenotípica, em concordância com a molecular, indicou alterações na produção de metabólitos secundários, mas não na produção de proteases. A biblioteca de agrotransformantes mostrou-se uma rica fonte para estudos de e caracterização funcional de genes envolvidos na interação da linhagem estudada com o fitopatógeno.Conselho Nacional de Desenvolvimento Científico e Tecnológico (CNPq).Trichoderma fungi are well known as biological control agents. The mechanisms involved in this process cover the triad pathogen-antagonist-plant interactions, in a complex integrated process that protects the plant and promotes its growth. In this project, we tried to identify potential gene targets applicable in genetic improvement of Trichoderma harzianum. A library of transformants from T. harzianum BRM27158, was built via Agrobacterium tumefaciens mediated transformation, with pFAT-gfp plasmid as binary vector, creating random T-DNA insertions containing hph (selective marker) and gfp (reporter) genes. The library was purified by monosporic cultivation and subjected to a preliminary screening, from which 10 strains were selected for further analysis. All selected agrotransformants exhibited genetic stability, keeping a hygromycin B resistance phenotype after 6 generations. Molecular verification of T-DNA insertions was performed by hph and gfp amplification using specific primers. The 10 selected fungi and wild type were characterized regarding their protease production in submerged cultivation and in solid medium. Four out of ten strains (T25, T40, T113 and T136) showed decreased growth in protein substrates. Moreover, the transformants, T40, T50 and T113 presented a reduced inhibition activity against the bacteria Staphylococcus aureus, compared to the wild type. The T-DNA flanking regions from each selected mutant were recovered via TAIL-PCR, cloned, sequenced and compared to NCBI and JGI databases and to BRM27158 annotated genome. An insertion in a gene coding a putative NRPS (non-ribosomal peptide synthase), involved in secondary metabolite production, was identified. Molecular and phenotypical characterizarion indicated alterations in secondary metabolite production, but not in protease production. The transformant library was established as a rich source for functional characterization of genes involved in interactions between phytopathogen and the studied strain.Noronha, Eliane FerreiraFávaro, Léia Cecília de LimaTamietti, Mariana Santos2019-04-26T23:02:57Z2019-04-26T23:02:57Z2019-04-262018-08-30info:eu-repo/semantics/publishedVersioninfo:eu-repo/semantics/masterThesisapplication/pdfTAMIETTI, Mariana Santos. Transformação de trichoderma harzianum BRM27158 por agrobacterium tumefaciens e caracterização de uma biblioteca de transformantes. 2018. 88 f., il. Dissertação (Mestrado em Biologia Molecular)—Universidade de Brasília, Brasília, 2018.http://repositorio.unb.br/handle/10482/34471A concessão da licença deste item refere-se ao termo de autorização impresso assinado pelo autor com as seguintes condições: Na qualidade de titular dos direitos de autor da publicação, autorizo a Universidade de Brasília e o IBICT a disponibilizar por meio dos sites www.bce.unb.br, www.ibict.br, http://hercules.vtls.com/cgi-bin/ndltd/chameleon?lng=pt&skin=ndltd sem ressarcimento dos direitos autorais, de acordo com a Lei nº 9610/98, o texto integral da obra disponibilizada, conforme permissões assinaladas, para fins de leitura, impressão e/ou download, a título de divulgação da produção científica brasileira, a partir desta data.info:eu-repo/semantics/openAccessporreponame:Repositório Institucional da UnBinstname:Universidade de Brasília (UnB)instacron:UNB2023-07-13T20:52:12Zoai:repositorio.unb.br:10482/34471Repositório InstitucionalPUBhttps://repositorio.unb.br/oai/requestrepositorio@unb.bropendoar:2023-07-13T20:52:12Repositório Institucional da UnB - Universidade de Brasília (UnB)false
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