Expressão de celulases recombinantes de insetos praga em Pichia Pastoris™

Detalhes bibliográficos
Autor(a) principal: Alves, Ana Elizebeth Oliveira de Araújo
Data de Publicação: 2020
Tipo de documento: Tese
Idioma: por
Título da fonte: Repositório Institucional da UnB
Texto Completo: https://repositorio.unb.br/handle/10482/38858
Resumo: Tese (doutorado)—Universidade de Brasília, Programa em Rede Multi-Institucional do Pró-Centro-Oeste de Pós-Graduação em Biotecnologia e Biodiversidade, 2020.
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spelling Expressão de celulases recombinantes de insetos praga em Pichia Pastoris™TranscriptomaClonagemEnzimasExpressão heterólogaTese (doutorado)—Universidade de Brasília, Programa em Rede Multi-Institucional do Pró-Centro-Oeste de Pós-Graduação em Biotecnologia e Biodiversidade, 2020.As celulases desempenham um papel significativo no processo industrial de degradação da celulose. Neste estudo, foi relatado a clonagem e a expressão heteróloga de uma β-glicosidase recombinante a partir do cDNA de T. licus licus (TlicB-gluc1) e uma β-1,4-endoglucanase recombinante do cDNA de A. grandis (AgraGH45-1). Os genes foram expressos em sistema heterólogo de Pichia pastorisTM.Baseado na predição de proteínas e busca por domínios conservados, foram clonadas as sequências gênicas TlicB-gluc1com identidade na família GH1 (Glicosil Hidrolase 1) e AgraGH45-1 com identidade na família GH45 (Glicosil Hidrolase 45). Os transcritos do gene clonado TlicB-gluc1apresentaram uma expressão gênica diferencial na fase larval adulta e no intestino médio em relação a carcaça e outras fases da vida do inseto. O perfil proteico do sobrenadante da colônia recombinante apresentou uma proteína diferencial de peso molecular estimado de aproximadamente 50 kDa. A enzima recombinante expressa mostrou-se ativa em pH 4,5 a 45 °C, de acordo com a faixa de pH e temperaturas das enzimas comerciais utilizadas nas indústrias. Também apresentou atividade β-glicosídica na degradação da carboximetilcelulose (CMC) e celobiose. No ensaio de açúcares redutores, observou-se a liberação de glicose no meio (4,76 mM) duas vezes superior em relação ao controle (2,13 mM). Os transcritos do gene clonado AgraGH45-1 apresentaram maior expressão gênica no intestino em ambos os estágios adulto e larval. O perfil protéico apresentou uma proteína de peso molecular estimado de aproximadamente 35 kDa. A enzima recombinante expressa mostrou-se ativa em pH 5,0 a 50 °C na degradação de CMC e Hidroxietilcelulose (HEC). As enzimas recombinantes produzidas enste estudo mostraram-se eficientes na degradação de celuloses amorfas. Estes dados reforçam a importância de identificar a bioquímica digestiva desses insetos-praga, visando o potencial na produção de ferramentas biotecnológicas.Cellulases play a significant role in the industrial process in the degradation of cellulose. In this study, we report the cloning and heterologous expression of a recombinant β-glucosidase from the Telchin licus licus cDNA (TlicB-gluc1), and a recombinant β-1,4-endoglucanase from the A. grandis cDNA (AgraGH45-1). The genes were expressed in a heterologous Pichia pastorisTM. Based on protein prediction and search for conserved domains, the TlicB-gluc1gene sequences with identity in the GH1 family (Glycosyl Hydrolase 1) and AgraGH45-1with identity in the GH45 family (Glycosyl Hydrolase 45) were cloned. The transcripts of the cloned TlicB-gluc1gene showed differential gene expression in the adult larval stage and in the midgut in relation to the carcass and other stages of the insect's life. The protein profile of the recombinant colony supernatant showed a differential protein with an estimated molecular weight of approximately 50 kDa. The recombinant enzyme expressed was active at pH 4,5 at 45 ° C according to the pH range and temperatures of the commercial enzymes used in the industries. It also showed β- glycosidic activity in the degradation of carboxymethylcellulose (CMC) and cellobiose. In the reducing sugar assay, glucose was released into the medium (4,76 mM) twice as high as the control (2,13 mM). The transcripts of the cloned AgraGH45-1gene showed higher gene expression in the intestine in both the adult and larval stages. The protein profile showed a protein with an estimated molecular weight of approximately 35 kDa. The expressed recombinant enzyme was active at pH 5,0 at 50 °C in the degradation of CMC and Hydroxyethylcellulose (HEC).The recombinant enzymes produced in this study proved to be efficient in the degradation of amorphous celluloses. These data reinforce the importance of identifying the digestive biochemistry of these insect-pests, aiming its application in the production of biotechnological tools.Sá, Maria Fátima Grossi deVasconcelos, Érico Augusto Rosas deAlves, Ana Elizebeth Oliveira de Araújo2020-07-03T10:39:19Z2020-07-03T10:39:19Z2020-07-032020-03-06info:eu-repo/semantics/publishedVersioninfo:eu-repo/semantics/doctoralThesisapplication/pdfALVES, Ana Elizebeth Oliveira de Araújo. Expressão de celulases recombinantes de insetos praga em pichia pastoris™. 2020. 87 f., il. Tese (Doutorado em Biotecnologia e Biodiversidade)—Universidade de Brasília, Brasília, Brasília, 2020.https://repositorio.unb.br/handle/10482/38858info:eu-repo/semantics/openAccessporreponame:Repositório Institucional da UnBinstname:Universidade de Brasília (UnB)instacron:UNB2023-07-25T02:24:12Zoai:repositorio.unb.br:10482/38858Repositório InstitucionalPUBhttps://repositorio.unb.br/oai/requestrepositorio@unb.bropendoar:2023-07-25T02:24:12Repositório Institucional da UnB - Universidade de Brasília (UnB)false
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