Identificação e expressão heteróloga de proteínas acessórias do fungo Thermomyces lanuginosus em Komagataella phaffii

Detalhes bibliográficos
Autor(a) principal: Serra, Luana Assis
Data de Publicação: 2019
Tipo de documento: Dissertação
Idioma: por
Título da fonte: Repositório Institucional da UnB
Texto Completo: http://repositorio2.unb.br/jspui/handle/10482/47426
Resumo: Dissertação (mestrado) — Universidade de Brasília, Instituto de Ciências Biológicas, Departamento de Biologia Celular, Pós-Graduação em Biologia Microbiana, 2019.
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As expansinas, expansinas-like e mono-oxigenases líticas de polissacarídeos (LPMOs) são exemplos de proteínas auxiliares que agem sinergicamente com enzimas lignocelulolíticas para a degradação dos componentes da biomassa. Sendo assim, visando a produção com alto rendimento e a redução de custos destas enzimas, a otimização de sistemas de expressão recombinantes em microrganismos é altamente desejada. Neste trabalho, a sequência de genes que codificam para duas LPMOs (TLPMO1 e TLPMO2) e duas expansinas-like da família cerato plataninas (CP) (TLEX2 e TLEX3) foram buscadas no genoma do fungo termofílico Thermomyces lanuginosus para expressão heteróloga na levedura Komagataella phaffii. As sequências gênicas foram otimizadas e clonadas em vetor de expressão com fatora de secreção (LPMO) e com fator de secreção nativo (expansina-like). Após a transformação genética de K. phaffii, os clones recombinantes foram cultivados em frascos Erlenmeyer e a expressão da proteína heteróloga foi avaliada pelas técnicas de SDS-PAGE e Western-blot. Dentre as expansinas-like, apenas a proteína TLEX2 foi detectada e se apresentou com tamanho próximo de 25 kDa. Apesar de clones recombinantes para TLPMO1 (sob controle do promotor GAP) terem sido obtidos, não houve detecção da proteína recombinante. A expressão de TLPMO1 e TLPMO2 foi então avaliada sob controle do promotor induzível AOX1. Colônias de K. Phaffii com TLPMO1 e TLPMO2 integrados foram obtidas e apenas a expressão da proteína recombinante TLPMO1 com tamanho aproximado de 55 kDa foi confirmada. As proteínas TLEX2 e TLPMO1 expressas foram purificadas por coluna de afinidade His-tag, alcançando a concentração máxima de proteína purificada de 0,017 mg/mL e 4,4 mg/mL, respectivamente. Ensaios de sinergismo com celulases foram realizados com TLEX2, porém a atividade da proteína não foi constatada. A atividade da TLPMO1 foi confirmada por ensaio amplex-RED, que permite a detecção de peróxido de hidrogênio (H2O2) formado pela enzima. Por fim, as proteínas expansina-like e LPMO provenientes de T. lanuginosus são descritas pela primeira vez neste trabalho e apresentam grande potencial em aplicações biotecnológicas.Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior (CAPES).The dependence on fossil fuels has promoted the development of alternative solutions based on biotechnological processes for the production of energy and chemicals from renewable sources. Lignocellulosic biomass presents great potential for the generation of biofuels, for example second generation ethanol, and other bioproducts such as organic acids. Cellulases, hemicellulases and proteins with auxiliary activity are essential in the process of liberating the biomass sugar monomers for subsequent conversion into value-added products. The expansins, expansins-like and lytic polysaccharides monooxygenases (LPMOs) are examples of auxiliary proteins that act synergistically with lignocellulolytic enzymes for the degradation of biomass components. In that way, aiming the production with high yield and reduction of costs of these enzymes, the optimization of recombinant expression systems in microorganisms are highly desired. In this work, the sequence of encoding genes for two LPMOs (TLPMO1 and TLPMO2) and two expansins-like from the cerato platanin (CP) family (TLEX2 and TLEX3) were searched in the genome of the thermophilic fungus Thermomyces lanuginosus for heterologous expression in the yeast Komagataella phaffii. The gene sequences were optimized and cloned into heterologous secretory factor (LPMO) and native secretory factor (expansin-like) expression vector. After the genetic transformation of K. phaffii, the recombinant clones were cultured in Erlenmeyer flasks and the expression of the heterologous protein was evaluated by SDS-PAGE and Western-blot techniques. Among the expansins-like, only the TLEX2 protein was detected and presented with an aproximated size of 25 kDa. Although recombinant clones for TLPMO1 (under GAP promoter control) were obtained, there was no detection of the recombinant protein. The expression of TLPMO1 and TLPMO2 was then evaluated under control of the AOX1 inducible promoter. K. Phaffii colonies with integrated TLPMO1 and TLPMO2 were obtained and only the expression of recombinant TLPMO1 protein with approximate size of 55 kDa was confirmed. Expressed TLEX2 and TLPMO1 proteins were purified by His-tag affinity column, reaching the maximum protein concentration of 0.017 mg/mL and 4.4 mg/ mL, respectively. Synergism tests with cellulases were performed with TLEX2, however the activity of the protein was not verified. The activity of TLPMO1 was confirmed by amplex- RED assay, which allows the detection of hydrogen peroxide (H2O2) formed by the enzyme. Finally, the proteins expansin-like and LPMO from T. lanuginosus are described for the first time in this work and present great potential for biotechnological applications.Instituto de Ciências Biológicas (IB)Departamento de Biologia Celular (IB CEL)Programa de Pós-Graduação em Biologia MicrobianaAlmeida, João Ricardo Moreira deMarco, Janice Lisboa deSerra, Luana Assis2024-01-20T16:19:46Z2024-01-20T16:19:46Z2024-01-202019-02-21info:eu-repo/semantics/publishedVersioninfo:eu-repo/semantics/masterThesisapplication/pdfSERRA, Luana Assis. Identificação e expressão heteróloga de proteínas acessórias do fungo Thermomyces lanuginosus em Komagataella phaffii. 2019. 95 f., il. Dissertação (Mestrado em Biologia Microbiana) — Universidade de Brasília, Brasília, 2019.http://repositorio2.unb.br/jspui/handle/10482/47426porinfo:eu-repo/semantics/openAccessreponame:Repositório Institucional da UnBinstname:Universidade de Brasília (UnB)instacron:UNB2024-01-20T16:19:46Zoai:repositorio.unb.br:10482/47426Repositório InstitucionalPUBhttps://repositorio.unb.br/oai/requestrepositorio@unb.bropendoar:2024-01-20T16:19:46Repositório Institucional da UnB - Universidade de Brasília (UnB)false
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