Avaliação de estratégias genéticas para a melhoria da produção de ácido lático em cepas da levedura komagataella phaffii

Detalhes bibliográficos
Autor(a) principal: Junqueira, Ana Caroline de Oliveira
Data de Publicação: 2023
Tipo de documento: Tese
Idioma: por
Título da fonte: Repositório Institucional da UnB
Texto Completo: http://repositorio2.unb.br/jspui/handle/10482/47475
Resumo: Tese (doutorado) — Universidade de Brasília, Instituto de Ciências Biológicas, Departamento de Biologia Celular, Programa de Pós-Graduação em Biologia Molecular, 2023.
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spelling Avaliação de estratégias genéticas para a melhoria da produção de ácido lático em cepas da levedura komagataella phaffiiMitocôndriaGlicerolFosfato desidrogenaseCatalaseHemoglobinaTese (doutorado) — Universidade de Brasília, Instituto de Ciências Biológicas, Departamento de Biologia Celular, Programa de Pós-Graduação em Biologia Molecular, 2023.O ácido lático é classificado como um químico plataforma devido às numerosas aplicações a que pode ser destinado industrialmente. Nos anos recentes, a maior parte da produção do ácido lático tem sido destinada à síntese do polímero polilactídeo (PLA), um bioplástico termoestável e compostável que pode ser uma alternativa sustentável aos plásticos convencionais derivados de petróleo. Uma das vias de obtenção do ácido lático é através da fermentação microbiana utilizando fontes de carbono renováveis. Porém, a produção via fermentação microbiana requer melhorias no bioprocesso para que o PLA se torne comercialmente competitivo. Em trabalhos anteriores do nosso grupo, a levedura Komagataella phaffii demonstrou capacidade de utilizar em fermentar o glicerol bruto, um subproduto da indústria do biodiesel. Assim, K. phaffii foi selecionada para a construção de linhagens produtoras de L-lactato, atingindo até o momento, o rendimento de 0,67 (g/g) em batelada-alimentada em hipóxia. Ao avaliar as cepas de K. phaffii construídas, há indícios de que as modificações anteriores, como a deleção da piruvato descarboxilase 1, resultam em um desbalanço do equilíbrio redox NADH/NAD+ o que poderia explicar a produção de arabitol como coproduto e a dificuldade em melhorar o rendimento de ácido lático. Portanto, diferentes alvos para expressão e nocaute foram avaliados neste trabalho com o objetivo de (a) corrigir o balanço redox na cepa GLp para evitar a redirecionamento do fluxo para vias competitivas; (b) viabilizar a produção de ácido lático em aerobiose; (c) avaliar diferentes LDHs e (d) superexpressar o gene responsável pelo transportador de lactato, Jen1. Na manipulação genética de K. phaffii, foi possível observar que (i) a utilização da técnica de amplificação do círculo rolante para amplificação de material genético resultou em uma maior obtenção de clones; (ii) a inserção de regiões de repetições diretas para guiar a excisão se mostrou eficaz para a reciclagem de marca; (iii) integrações em locus com regiões repetidas resulta em instabilidade da integração. Em relação aos alvos testados para melhorar a produção de ácido lático, concluímos que a deleção do gene do transportador mitocondrial de piruvato em K. phaffii não foi vantajosa, visto que houveram impactos deletérios no crescimento sem ganhos na produção de ácido lático. As observações deste trabalho indicam que a cepa GLp cultivada em batelada-alimentada e com limitação de oxigênio é ainda a melhor candidata para a produção de ácido lático a partir de glicerol.Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior (CAPES) e Fundação de Apoio à Pesquisa do Distrito Federal (FAP/DF).Lactic acid can be classified as a platform chemical due to its numerous industrial applications. In recent years, the lactic acid produced is mainly used for the synthesis of polylactides (PLA), a thermostable and compostable bioplastic that can replace conventional plastics derived from the petrochemical industry. One route to obtain lactic acid is through microbial fermentation using renewable carbon sources as substrate. However, microbial fermentation requires improvements in order to make PLA commercially competitive. In previous works by our group, the ability to use crude glycerol, a by-product from the biodiesel industry, by the yeast Komagataella phaffii was assessed. Then, K. phaffii was selected for the construction of L-lactate-producing strains, reaching the yield of 0.67 (g/g) in fed-batch mode in hypoxia. However, by assessing the previous strains, there are indications that the modifications, such as the deletion of pyruvate decarboxylase 1, resulted in an imbalance in the NADH/NAD+ redox balance, which could explain the production of arabitol as a co-product and the difficulty in improving the yield of lactic acid. Therefore, targets of gene expression and knockout were evaluated in this work with the aim of (a) adjusting the redox balance in the GLp strain to avoid the redirection of the metabolic route into arabitol; (b) enabling the production of lactic acid under aerobic conditions; (c) evaluate different LDHs and (d) overexpress the gene responsible for the lactate transporter, Jen1. In the genetic manipulation of K. phaffii, it was possible to observe that (i) the use of the rolling circle amplification for the amplification resulted in a more significant number of clones; (ii) the insertion of direct repeats showed to be effective for recycling the selection marker; (iii) integrations with repeated sequences resulted in instability of gene integrations. Regarding the targets tested to improve lactic acid production, we concluded that the deletion of the mitochondrial pyruvate transporter gene in K. phaffii did not improve lactic acid production. The observations of this work indicate that the GLp strain grown fed-batch mode with oxygen limitation is the best candidate for the production of lactic acid from glycerol.Instituto de Ciências Biológicas (IB)Departamento de Biologia Celular (IB CEL)Programa de Pós-Graduação em Biologia MolecularParachin, Nádia SkorupaPaes, Hugo CostaJunqueira, Ana Caroline de Oliveira2024-01-24T18:20:59Z2024-01-24T18:20:59Z2024-01-242023-03-29info:eu-repo/semantics/publishedVersioninfo:eu-repo/semantics/doctoralThesisapplication/pdfJUNQUEIRA, Ana Caroline de Oliveira. Avaliação de estratégias genéticas para a melhoria da produção de ácido lático em cepas da levedura komagataella phaffii. 2023. 106 f., il. Tese (Doutorado em Biologia Molecular) — Universidade de Brasília, Brasília, 2023.http://repositorio2.unb.br/jspui/handle/10482/47475A concessão da licença deste item refere-se ao termo de autorização impresso assinado pelo autor com as seguintes condições: Na qualidade de titular dos direitos de autor da publicação, autorizo a Universidade de Brasília e o IBICT a disponibilizar por meio dos sites www.unb.br, www.ibict.br, www.ndltd.org sem ressarcimento dos direitos autorais, de acordo com a Lei nº 9610/98, o texto integral da obra supracitada, conforme permissões assinaladas, para fins de leitura, impressão e/ou download, a título de divulgação da produção científica brasileira, a partir desta data.info:eu-repo/semantics/openAccessporreponame:Repositório Institucional da UnBinstname:Universidade de Brasília (UnB)instacron:UNB2024-01-24T18:20:59Zoai:repositorio.unb.br:10482/47475Repositório InstitucionalPUBhttps://repositorio.unb.br/oai/requestrepositorio@unb.bropendoar:2024-01-24T18:20:59Repositório Institucional da UnB - Universidade de Brasília (UnB)false
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