Interferência de RNA direcionada ao canal de potássio Eag1 : efeitos sobre a expressão gênica e viabilidade celular do glioma

Detalhes bibliográficos
Autor(a) principal: Cunha, Ludmylla Costa
Data de Publicação: 2012
Tipo de documento: Dissertação
Idioma: por
Título da fonte: Repositório Institucional da UnB
Texto Completo: http://repositorio.unb.br/handle/10482/11664
Resumo: Dissertação (mestrado)—Universidade de Brasília, Faculdade de Ciências da Saúde, Programa de Pós-Graduação em Ciências da Saúde, 2012.
id UNB_c350fc4cae9fb9dbfacd09d1505efd87
oai_identifier_str oai:repositorio2.unb.br:10482/11664
network_acronym_str UNB
network_name_str Repositório Institucional da UnB
repository_id_str
spelling Cunha, Ludmylla CostaAlmeida, Ricardo Titze de2012-11-22T12:01:03Z2012-11-22T12:01:03Z2012-11-222012-08-02CUNHA, Ludmylla Costa. Interferência de RNA direcionada ao canal de potássio Eag1: efeitos sobre a expressão gênica e viabilidade celular do glioma. 2012. 55 f., il. Dissertação (Mestrado em Ciências da Saúde)—Universidade de Brasília, Brasília, 2012.http://repositorio.unb.br/handle/10482/11664Dissertação (mestrado)—Universidade de Brasília, Faculdade de Ciências da Saúde, Programa de Pós-Graduação em Ciências da Saúde, 2012.Gliomas representam o tipo de tumor cerebral primário de maior malignidade. Entre as alterações que conferem competência tumoral ao glioma, está o aumento na expressão do canal de potássio hEag1. Na última década, a interferência de RNA (RNAi) tem se destacado como técnica para estudo da função de genes em mamíferos, via silenciamento gênico pós-transcricional. Neste sentido, a técnica de RNAi foi utilizada no atual estudo para silenciar o gene Eag1 em células de glioma. Na primeira etapa deste projeto, foram identificados alvos para RNAi na região codante do gene hEag1 (NM_172362.2), via algoritmo baseado em redes neurais artificiais. Foram identificados 25 alvos de RNAi, com escores variando de 0,82 a 0,87, e selecionados para o atual estudo os dois alvos com maiores escores. Foi realizada síntese química de siRNAs para estes alvos situados nos exons 2 e 8, daí a denominação e2_hEag1 e e8_hEag1. Também foram sintetizados o siRNA controle positivo descrito anteriormente Kv10.1-3 e o controle negativo scramble (Qiagen). Foi inicialmente determinado o ponto temporal (4h, 8h, ou 48h) e a concentração (18,75 nM, 37,5 nM ou 75,0 nM) de maior silenciamento de hEag1, utilizando-se os siRNAs controles transfectados em lipossomas catiônicos. O maior silenciamento foi observado no tempo de 8h pós-transfecção, na menor dosagem testada, 18,75 nM. Nesta condição experimental, foi testado o grau de silenciamento de Eag1 causado pelos dois novos siRNAs, em comparação com o controle positivo Kv10.1-3. Ambos siRNAs desenhados no atual estudo -e2_hEag1 e e8_hEag1 -foram mais efetivos que o controle positivo Kv10.1-3, reduzindo assim o conteúdo relativo de hEag1 em 0,46 vezes e 0,52 vezes, respectivamente, em relação ao valor obtido no controle negativo scramble (p < 0,05). Na última etapa deste estudo, foi avaliado se vetores de expressão de short hairpins RNAs (shRNA) direcionados ao alvo 5´ GTCCACTTGGTCCATGTCCAG 3´ do controle positivo Kv10.1-3 (pKv10.1-3hum_LI), causariam alteração de fenótipo celular, ou seja, redução da viabilidade dos gliomas. O efeito destes vetores de expressão (pKv10.1-3hum_LI ou pScramble, dose de 0,2 µg) sobre a viabilidade de gliomas, em uso isolado ou em combinação com interferon gama (IFN-y, 25 ng/mL ) foi testado pelo ensaio de MTT. A redução de viabilidade obtida com a combinação do vetor pKv10.1-3hum_LI e IFN-y (40,4 %)foi superior àquela obtida com o uso isolado de ambos, 16,0% e 11,4%, nesta ordem (p < 0,05). Este efeito sinérgico não foi observado com o vetor controle negativo pScramble, o que indica tratar-se de efeito sequência-específico, ou seja, dependente da sequência do shRNA expresso pelo vetor pKv10.1-3hum_LI. Em síntese, o presente estudo mostra que é possível silenciar a expressão de hEag1 de gliomas via siRNAs sintéticos. Além disto, revela a importância de hEag1 para a viabilidade celular do glioma, principalmente durante a injúria por IFN-y. No sentido tecnológico, o atual estudo apresenta um protocolo inovador com potencial uso na terapêutica de gliomas, baseado na associação de RNAi sobre hEag1 com o agente imunomodulador IFN-y. ______________________________________________________________________________ ABSTRACTGlioma is the most common type of primary malignant brain tumor. The disease presents poor clinical outcome and the treatment is essentially palliative. Among the genetic changes that confer capability to tumor cells is the hEag1 gene overexpression. RNA interference (RNAi) has rapidly advanced into a practical technique for mammalian gene function studies, through post-transcriptional genetic silencing. The technique was used in the present study to silence hEag1 gene in glioma cells in culture. We first identified RNAi targets in the coding region of hEag1 (NM_172362.2) by using algorithms based on artificial neural networks. Twenty-five hEag1 RNAi targets were found, with scores ranging from 0.82 to 0.87; the two highest rated were selected. They were chemically synthesized as short interfering RNAs (siRNAs), and designated e2_hEag1 and e8_hEag1, according to the targeted exon. Positive and negative siRNA controls were the previously published Kv10.1-3, and the scramble All Star (Qiagen), respectively. We first determined the time-point (4h, 8h, or 48h) and siRNA concentration (18.75 nM, 37.5 nM, or 75.0 nM) that provide the highest silencing effect, by using RT-qPCR. The best hEag1 knock-down occurred at 8h post-transfection with 18.75 nM siRNA concentration. We used this experimental condition to compare the two new siRNAs - e2_hEag1 and e8_hEag1 – with the positive control Kv10.1-3. Both siRNAs in test produced higher silencing effects compared to Kv10.1-3 (p < 0.05). The mRNA fold decrease varied from 0.46 to 0.52, according to each transfected siRNA e2_hEag1 or e8_hEag1, respectively. Finally, we evaluated whether an expressed short hairpin RNA (shRNA) to the same hEag1 Kv10.1-3 target sequence (5´- GTCCACTTGGTCCATGTCCAG 3´) would decrease the glioma cell viability. The expression vectors (pKv10.1-3hum_LI or a scramble control one pScramble, dose 0.2 µg) were transfected into glioma cells, with or without interferon gamma concurrent treatment (IFN- y, 25 ng/mL ) viability was determined by MTT assay. The association of the vector pKv10.1-3hum_LI and IFN- y decreased the glioma cell viability to 40.4%, which surpassed the results obtained from their isolate use, 16.0% and 11.4%, respectively (p<0.05). As pScramble showed no synergism with IFN- y we consider the pKv10.1-3hum_LI effects were sequence-specific. In conclusion, this study showed the ability of two unpublished siRNAs to knock-down hEag1. Our results are in agreement with previous data that established a role for Eag1 in the tumor cell viability. This role seems to be even more important during IFN-y injury. Regarding to biotechnology, this study presents an innovative treatment able to reduce the glioma cell viability, based on the association of shRNA expression vector to hEag1 and the immunomodulatory agent IFN- y.Faculdade de Ciências da Saúde (FS)Programa de Pós-Graduação em Ciências da SaúdeA concessão da licença deste item refere-se ao termo de autorização impresso assinado pelo autor com as seguintes condições: Na qualidade de titular dos direitos de autor da publicação, autorizo a Universidade de Brasília e o IBICT a disponibilizar por meio dos sites www.bce.unb.br, www.ibict.br, http://hercules.vtls.com/cgi-bin/ndltd/chameleon?lng=pt&skin=ndltd sem ressarcimento dos direitos autorais, de acordo com a Lei nº 9610/98, o texto integral da obra disponibilizada, conforme permissões assinaladas, para fins de leitura, impressão e/ou download, a título de divulgação da produção científica brasileira, a partir desta data.info:eu-repo/semantics/openAccessInterferência de RNA direcionada ao canal de potássio Eag1 : efeitos sobre a expressão gênica e viabilidade celular do gliomainfo:eu-repo/semantics/publishedVersioninfo:eu-repo/semantics/masterThesisCérebro - tumoresTerapia gênicaporreponame:Repositório Institucional da UnBinstname:Universidade de Brasília (UnB)instacron:UNBLICENSElicense.txtlicense.txttext/plain778http://repositorio2.unb.br/jspui/bitstream/10482/11664/2/license.txt294c83bf53fcb01e9aba4efb1416a8c3MD52open accessORIGINAL2012_LudmyllaCostaCunha.pdf2012_LudmyllaCostaCunha.pdfapplication/pdf2551853http://repositorio2.unb.br/jspui/bitstream/10482/11664/3/2012_LudmyllaCostaCunha.pdfb1829e698bffa4ba1cf62c91e4379039MD53open access10482/116642024-02-06 17:50:52.984open accessoai:repositorio2.unb.br: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Biblioteca Digital de Teses e DissertaçõesPUBhttps://repositorio.unb.br/oai/requestopendoar:2024-02-06T20:50:52Repositório Institucional da UnB - Universidade de Brasília (UnB)false
dc.title.en.fl_str_mv Interferência de RNA direcionada ao canal de potássio Eag1 : efeitos sobre a expressão gênica e viabilidade celular do glioma
title Interferência de RNA direcionada ao canal de potássio Eag1 : efeitos sobre a expressão gênica e viabilidade celular do glioma
spellingShingle Interferência de RNA direcionada ao canal de potássio Eag1 : efeitos sobre a expressão gênica e viabilidade celular do glioma
Cunha, Ludmylla Costa
Cérebro - tumores
Terapia gênica
title_short Interferência de RNA direcionada ao canal de potássio Eag1 : efeitos sobre a expressão gênica e viabilidade celular do glioma
title_full Interferência de RNA direcionada ao canal de potássio Eag1 : efeitos sobre a expressão gênica e viabilidade celular do glioma
title_fullStr Interferência de RNA direcionada ao canal de potássio Eag1 : efeitos sobre a expressão gênica e viabilidade celular do glioma
title_full_unstemmed Interferência de RNA direcionada ao canal de potássio Eag1 : efeitos sobre a expressão gênica e viabilidade celular do glioma
title_sort Interferência de RNA direcionada ao canal de potássio Eag1 : efeitos sobre a expressão gênica e viabilidade celular do glioma
author Cunha, Ludmylla Costa
author_facet Cunha, Ludmylla Costa
author_role author
dc.contributor.author.fl_str_mv Cunha, Ludmylla Costa
dc.contributor.advisor1.fl_str_mv Almeida, Ricardo Titze de
contributor_str_mv Almeida, Ricardo Titze de
dc.subject.keyword.en.fl_str_mv Cérebro - tumores
Terapia gênica
topic Cérebro - tumores
Terapia gênica
description Dissertação (mestrado)—Universidade de Brasília, Faculdade de Ciências da Saúde, Programa de Pós-Graduação em Ciências da Saúde, 2012.
publishDate 2012
dc.date.submitted.none.fl_str_mv 2012-08-02
dc.date.accessioned.fl_str_mv 2012-11-22T12:01:03Z
dc.date.available.fl_str_mv 2012-11-22T12:01:03Z
dc.date.issued.fl_str_mv 2012-11-22
dc.type.status.fl_str_mv info:eu-repo/semantics/publishedVersion
dc.type.driver.fl_str_mv info:eu-repo/semantics/masterThesis
format masterThesis
status_str publishedVersion
dc.identifier.citation.fl_str_mv CUNHA, Ludmylla Costa. Interferência de RNA direcionada ao canal de potássio Eag1: efeitos sobre a expressão gênica e viabilidade celular do glioma. 2012. 55 f., il. Dissertação (Mestrado em Ciências da Saúde)—Universidade de Brasília, Brasília, 2012.
dc.identifier.uri.fl_str_mv http://repositorio.unb.br/handle/10482/11664
identifier_str_mv CUNHA, Ludmylla Costa. Interferência de RNA direcionada ao canal de potássio Eag1: efeitos sobre a expressão gênica e viabilidade celular do glioma. 2012. 55 f., il. Dissertação (Mestrado em Ciências da Saúde)—Universidade de Brasília, Brasília, 2012.
url http://repositorio.unb.br/handle/10482/11664
dc.language.iso.fl_str_mv por
language por
dc.rights.driver.fl_str_mv info:eu-repo/semantics/openAccess
eu_rights_str_mv openAccess
dc.source.none.fl_str_mv reponame:Repositório Institucional da UnB
instname:Universidade de Brasília (UnB)
instacron:UNB
instname_str Universidade de Brasília (UnB)
instacron_str UNB
institution UNB
reponame_str Repositório Institucional da UnB
collection Repositório Institucional da UnB
bitstream.url.fl_str_mv http://repositorio2.unb.br/jspui/bitstream/10482/11664/2/license.txt
http://repositorio2.unb.br/jspui/bitstream/10482/11664/3/2012_LudmyllaCostaCunha.pdf
bitstream.checksum.fl_str_mv 294c83bf53fcb01e9aba4efb1416a8c3
b1829e698bffa4ba1cf62c91e4379039
bitstream.checksumAlgorithm.fl_str_mv MD5
MD5
repository.name.fl_str_mv Repositório Institucional da UnB - Universidade de Brasília (UnB)
repository.mail.fl_str_mv
_version_ 1803573632837877760

Registros relacionados