Obtenção de matriz extracelular descelularizada de córtex ovariano bovino e sua caracterização

Detalhes bibliográficos
Autor(a) principal: León Félix, Cecibel María
Data de Publicação: 2023
Tipo de documento: Tese
Idioma: por
Título da fonte: Repositório Institucional da UnB
Texto Completo: http://repositorio2.unb.br/jspui/handle/10482/47377
Resumo: Tese (doutorado) — Universidade de Brasília, Instituto de Ciências Biológicas, Programa de Pós-Graduação em Biologia Animal, 2023.
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spelling Obtenção de matriz extracelular descelularizada de córtex ovariano bovino e sua caracterizaçãoTecido ovarianoSaúde da mulherÓrgãos artificiaisTese (doutorado) — Universidade de Brasília, Instituto de Ciências Biológicas, Programa de Pós-Graduação em Biologia Animal, 2023.A descelularização da matriz extracelular (MEC) de tecido ovariano está sendo investigada como uma possibilidade de desenvolvimento de um ovário artificial transplantável (OAT), uma alternativa que surge para preservar a fertilidade em mulheres diagnosticadas com câncer, que poderiam se tornar inférteis devido à quimioterapia e/ou radioterapia. Os métodos existentes de obtenção de MEC descelularizada (dMEC) do tecido ovariano não foram otimizados e só alcançaram sucesso em camundongos. Os objetivos do presente estudo foram (1) obter uma dMEC de tecido ovariano de bovino usando a menor concentração de docedil sulfato de dódio (SDS) e o menor tempo de incubação que garantam a descelularização; e (2) analisar a proteômica da MEC antes e depois da descelularização. Para a obtenção da dMEC de córtex ovariano bovino, foram testadas as concentrações de SDS e NaOH de 1% e 0,2M, 0,5% e 0,1M, 0,1% e 0,02M, e 0,05% e 0,01%, com tempos de incubação de 24h, 12h e 6h. O tecido obtido de cada tratamento foi analisado por histologia, eletroforese e quantificação do DNA para verificar a descelularização. A análise histológica confirmou a descelularização, e a coloração com tricrômico de Mallory mostrou a conservação das fibras de colágeno em todas as amostras após cada tratamento. Além disso, a menor concentração de SDS que não mostrou DNA remanescente na análise de eletroforese foi de 0,1%, quando incubado por 24h e 12h. A quantificação do DNA resultou em < 0.2 ng DNA/mg de tecido ovariano utilizando estes protocolos. Ademais, a viabilidade celular mostrou que a dMEC (obtida por 0,1% de SDS e 0,02M NaOH por 12h) não era tóxico para as células ovarianas humanas durante o cultivo in vitro por até 72h. Por meio de análise proteômica foram identificadas 155 proteínas do matrisome MEC nativa do córtex ovariano bovino, e 145 na dMEC. Após a descelularização, apenas 10 proteínas do matrisome foram perdidas, e nenhuma delas pertencia à categoria de processos biológicos reprodutivos. Também, demonstramos que o colágeno tipo VI alfa 3 e heparan sulfate proteoglycan 2 foram os componentes mais abundantes da MEC ovariana bovina. As análises bioinformáticas mostraram que as proteínas, tanto da MEC nativa como da dMEC, apresentam funções que se enquadram em 12 processos biológicos, 19 componentes celulares e 13 funções moleculares. Os resultados obtidos neste trabalho podem contribuir para a compreensão das funções desempenhadas pelas proteínas da MEC ovariana nos processos de ovogênese, foliculogênese e esteroidogênese. Além disso, as proteínas identificadas da MEC podem servir como base de novos materiais para um OAT.Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior - Brasil (CAPES)Decellularization of the ovarian tissue extracellular matrix (ECM) is being investigated as a potential approach for developing a transplantable artificial ovary (TAO). This alternative aims to preserve fertility in women diagnosed with cancer, who could become infertile due to chemotherapy and/or radiotherapy. Existing methods to obtain decellularized ECM (dECM) from ovarian tissue are arbitrary and have only been successful in mice. The objectives of this study were: (1) to obtain dECM from bovine ovarian tissue using minimum concentration of SDS and incubation period that ensures decellularization; and (2) to analyze the ECM before and after decellularization through proteomics. To obtain dECM from bovine ovarian cortex, SDS and NaOH concentrations of 1% and 0.2M, 0.5% and 0.1M, 0.1% and 0.02M, and 0.05% and 0.01% were tested, with incubation times of 24h, 12h, and 6h. The tissue from each treatment was analyzed through histology, electrophoresis, and DNA quantification to confirm decellularization. Histological analysis confirmed decellularization, and Mallory's trichrome staining showed the preservation of collagen and elastin fibers in all samples after each treatment. Moreover, the lowest concentration of SDS that showed no remaining DNA in electrophoresis analysis was 0.1%, when incubated for 24h and 12h. DNA quantification resulted in < 0.2 ng DNA/mg of ovarian tissue using these protocols. Additionally, cell viability showed that the dECM (obtained using 0.1% SDS and 0.02M NaOH for 12h) was not toxic to human ovarian cells during in vitro culture for up to 72h. Through proteomic analysis, 155 proteins from the native matrisome of bovine ovarian cortex were identified, along with 145 in the dECM. After decellularization, only 10 matrisome proteins were lost, none of which belonged to the category of reproductive biological processes. Bioinformatics analyses revealed that both native and dECM proteins have functions related to 12 biological processes, 19 cellular components, and 13 molecular functions. Additionally, collagen type VI alpha 3 and heparan sulfate proteoglycan 2 were identified as the most abundant components of bovine ovarian ECM. The results obtained in this study may contribute to the understanding of the functions carried out by ovarian ECM proteins in the processes of oogenesis, folliculogenesis, and steroidogenesis. Furthermore, the proteins identified within the ECM may serve as a foundation for the development of new materials for an TAO.Instituto de Ciências Biológicas (IB)Programa de Pós-Graduação em Biologia AnimalLucci, Carolina MadeiraLeón Félix, Cecibel María2024-01-18T21:09:58Z2024-01-18T21:09:58Z2024-01-182023-08-31info:eu-repo/semantics/publishedVersioninfo:eu-repo/semantics/doctoralThesisapplication/pdfObtenção de matriz extracelular descelularizada de córtex ovariano bovino e sua caracterização. 2023. 108 f., il. Tese (Doutorado em Biologia Animal) — Universidade de Brasília, Brasília, 2023.http://repositorio2.unb.br/jspui/handle/10482/47377porinfo:eu-repo/semantics/openAccessreponame:Repositório Institucional da UnBinstname:Universidade de Brasília (UnB)instacron:UNB2024-01-18T21:09:59Zoai:repositorio.unb.br:10482/47377Repositório InstitucionalPUBhttps://repositorio.unb.br/oai/requestrepositorio@unb.bropendoar:2024-01-18T21:09:59Repositório Institucional da UnB - Universidade de Brasília (UnB)false
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