Clonagem e expressão de L-asparaginase de Fusarium proliferatum em Escherichia coli

Detalhes bibliográficos
Autor(a) principal: Abrunhosa, Letícia Santos
Data de Publicação: 2023
Tipo de documento: Dissertação
Idioma: por
Título da fonte: Repositório Institucional da UnB
Texto Completo: http://repositorio2.unb.br/jspui/handle/10482/50134
Resumo: Dissertação (mestrado) — Universidade de Brasília, Faculdade de Ciências da Saúde, Programa de Pós-Graduação em Ciências da Saúde, 2023.
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Uma alternativa para a enzima que se encontra no mercado seria a clonagem e expressão de L-asparaginase de Fusarium proliferatum em Escherichia coli, com objetivo de atenuar os efeitos adversos produzidos por ser uma enzima de origem procariótica. Tendo isso em vista, o objetivo desse trabalho foi realizar a clonagem de L-asparaginase obtida por Fusarium proliferatum e expressá-la em Escherichia coli BL21(DE3). Foi realizada a síntese do gene da L-asparaginase de F. proliferatum em vetor pET-28a(+) com otimização de códons para E. coli e sítios de restrição NdeI/XhoI. Em sequência, foi realizada transformação para replicação em E. coli DH10B e transformação para expressão em E. coli BL21(DE3). Após a confirmação da inserção do vetor no sistema de expressão, foram selecionados clones para serem avaliados quanto à produção de L-asparaginase, com posterior avaliação do crescimento microbiano, métodos de rompimento celular e screening para avaliar algumas condições de cultivo, com variação da concentração do indutor IPTG, tempo pós indução e temperatura de indução. As frações solúvel e insolúvel foram utilizadas para a realização do ensaio enzimático, onde a atividade de L-asparaginase foi medida pelo método de Nessler e do ß-hidroxamato aspártico. A melhor metodologia para lise celular consistiu em 10 ciclos de sonicação, sendo cada ciclo composto por 1 segundo ON e 1 segundo OFF, e intervalo de 1 minuto entre cada ciclo. Dentre as variáveis analisadas em relação ao cultivo e indução, o crescimento bacteriano a 37 ºC por 2h30, com indução por IPTG 0,5 mM, temperatura de indução de 20 ºC e tempo pós indução de 12 horas representou a melhor condição para expressão da enzima. Ambas metodologias de quantificação enzimática, após concentração das frações, apresentaram atividade de L-asparaginase na fração solúvel, sendo 0,449 UI/mL pelo método de Nessler e 0,082 UI/mL pelo método do AHA.Conselho Nacional de Desenvolvimento Científico e Tecnológico (CNPq).L-asparaginase is an enzyme used for the treatment of Acute Lymphoblastic Leukemia, which mainly affects children and adolescents, and it has the ability to hydrolyze L-asparagine into L-aspartate and ammonia. Clinical preparations of this enzyme are derived from prokaryotic source and its use is often associated with serious adverse reactions. For several years, Brazil has been importing this medication due to the lack of national production. An alternative to the enzyme available in the market would be cloning and expression L-asparaginase from Fusarium proliferatum in Escherichia coli, with the aim of attenuating the adverse effects of prokaryotic enzyme. The objective of this work was to clone L-asparaginase from Fusarium proliferatum and express in Escherichia coli BL21(DE3). The synthesis of the Lasparaginase gene from F. proliferatum was carried out in pET-28a(+) vector with codon optimization for E. coli and NdeI/XhoI restriction sites. Subsequently, transformation for replication in E. coli DH10B and transformation for expression in E. coli BL21(DE3) were performed. After confirming the vector insertion into the expression system, clones were selected to be evaluated for L-asparaginase production, with subsequent evaluation of microbial growth, cell disruption methods, and screening of cultivation conditions, with variation in IPTG inducer concentration, post-induction time and induction temperature. Soluble and insoluble fractions were used for enzymatic assay, where L-asparaginase activity was measured by Nessler and ß-hydroxamate aspartic acid methods. The best methodology for cell lysis consisted of 10 cycles of sonication, each cycle composed of 1 second ON and 1 second OFF, and a 1-minute interval between each cycle. Among the variables analyzed regarding cultivation and induction, bacterial growth at 37 °C for 2h30, with induction by 0,5 mM IPTG, an induction temperature of 20 °C, and a post-induction time of 12 hours represented the best condition for enzyme expression. Both enzymatic quantification methodologies, after concentration of the fractions, showed L-asparaginase activity in the soluble fraction of 0,449 IU/mL using Nessler reagent and 0,082 IU/mL using AHA.Faculdade de Ciências da Saúde (FS)Programa de Pós-Graduação em Ciências da SaúdeBatista, Pérola de Oliveira Magalhães DiasAbrunhosa, Letícia Santos2024-08-22T21:00:34Z2024-08-22T21:00:34Z2024-08-222023-08-31info:eu-repo/semantics/publishedVersioninfo:eu-repo/semantics/masterThesisapplication/pdfABRUNHOSA, Letícia Santos. Clonagem e expressão de L-asparaginase de Fusarium proliferatum em Escherichia coli. 2023. 100 f., il. Dissertação (Mestrado em Ciências da Saúde) — Universidade de Brasília, Brasília, 2023.http://repositorio2.unb.br/jspui/handle/10482/50134A concessão da licença deste item refere-se ao termo de autorização impresso assinado pelo autor com as seguintes condições: Na qualidade de titular dos direitos de autor da publicação, autorizo a Universidade de Brasília e o IBICT a disponibilizar por meio dos sites www.unb.br, www.ibict.br, www.ndltd.org sem ressarcimento dos direitos autorais, de acordo com a Lei nº 9610/98, o texto integral da obra supracitada, conforme permissões assinaladas, para fins de leitura, impressão e/ou download, a título de divulgação da produção científica brasileira, a partir desta data.info:eu-repo/semantics/openAccessporreponame:Repositório Institucional da UnBinstname:Universidade de Brasília (UnB)instacron:UNB2024-08-22T21:00:34Zoai:repositorio.unb.br:10482/50134Repositório InstitucionalPUBhttps://repositorio.unb.br/oai/requestrepositorio@unb.bropendoar:2024-08-22T21:00:34Repositório Institucional da UnB - Universidade de Brasília (UnB)false
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