Toxinas Cry : potencial uso no controle da broca gigante da cana-de-açúcar (Telchin licus licus)

Detalhes bibliográficos
Autor(a) principal: Gomes Júnior, José Edilson
Data de Publicação: 2012
Tipo de documento: Tese
Idioma: por
Título da fonte: Repositório Institucional da UnB
Texto Completo: https://repositorio.unb.br/handle/10482/36115
Resumo: Tese (doutorado)—Universidade de Brasília, Instituto de Ciências Biológicas, Departamento de Biologia Celular, Programa de Pós-Graduação em Biologia Molecular, 2012.
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spelling Toxinas Cry : potencial uso no controle da broca gigante da cana-de-açúcar (Telchin licus licus)Cana-de-açúcarCana-de-açucar - doenças e pragasToxinas CryMariposaTese (doutorado)—Universidade de Brasília, Instituto de Ciências Biológicas, Departamento de Biologia Celular, Programa de Pós-Graduação em Biologia Molecular, 2012.No Brasil, a cultura da cana-de-açúcar (Saccharum qfficinarum L.) possui grande destaque, com aproximadamente 40% da produção mundial. Apresenta estimativa de produção de 571.471,0 milhões de toneladas para a safra 2011/2012, sendo uma alternativa interessante e ecologicamente correta para a produção de fontes de energia renováveis. Embora o Brasil esteja classificado entre os líderes mundiais na produção de cana-de-açúcar, regiões como o Nordeste e o Sudeste apresentam problemas econômicos relacionados a danos causados pelo ataque de insetos-praga, destacando-se a broca gigante da cana-de-açúcar (Telchin licus licus) (Lep.: Castniidae) e a broca da cana-de-açúcar (Diatraea saccharalis) (Lep.: Crambidae), respectivamente. A dificuldade no controle dessas pragas está no fato de possuírem hábito endofítico, que impede a ação dos inseticidas químicos. Neste contexto, várias proteínas entomotóxicas têm sido descritas como potenciais candidatas para o controle de insetos-praga. As toxinas Cry ou ô-endotoxinas, secretadas pela bactéria gram-positiva Bacillus thuringiensis (Bt), são moléculas efetivamente usadas no controle de insetos-praga, devido a sua especificidade e toxicidade a algumas ordens de insetos. Nesse trabalho, o objetivo é selecionar toxinas Cry eficazes contra T. I. licus, aplicando as técnicas de DNA shufjling e Phage display. Resultados de bioensaios utilizando cepas de Bt (Bt sor. kurstaki S2195 e S1905 e Bt sor. tolworthi S135 e S62) e larvas de Io instar de T. I. licus indicaram alta mortalidade nos tratamentos com Bt sor. kurstaki. Os genes cry presentes nessa sorovariedade de Bt foram determinados e ensaios de dilatação osmótica baseados em espalhamento de luz, indicaram que as toxinas CrylAa, CrylAb, Cryl Ac, Cryllal2 e Cry2Aa foram capazes de formar poros nas BBMVs de T. I. licus. Em bioensaios contendo tratamentos com as mesmas toxinas Cry (1 mg/mL) e larvas de T. I. licus foi demonstrada efetividade, com taxa de mortalidade de aproximadamente 90%. Visando a obtenção de novas moléculas de genes cry através da técnica de evolução molecular in vitro (DNA shuffling), a análise de seqüências nucleotídicas entre os genes crylAa, crylla!2 e cry2Aa foi realizada e os dois primeiros genes foram escolhidos para serem recombinados por essa técnica, pois apresentam maior identidade nucleotídica. Após o DNA shuffling, foi obtida uma biblioteca combinatória contendo 1,36 x 106 genes crylAa e cryllal2 variantes. Antes de iniciar a seleção das variantes Cry utilizando Phage display (biopanning), os receptores presentes nas membranas do intestino (BBMVs) das larvas de broca gigante da cana-de-açúcar foram testados quanto a sua qualidade e apresentaram um enriquecimento de 7,0 a 13,5 vezes em relação às enzimas marcadoras testadas. Foram selecionados cinco genes cry variantes mostrando afinidade às BBMVs de T. I. licus. Estes foram expressos em E. coli e as proteínas validadas por bioensaios e em ensaios de ligação às BBMVs. Foram identificadas duas toxinas Cry 1 Ia 12 variantes com aumento na atividade entomotóxica de 2,5 a 3,5 vezes, comparado com a toxina selvagem, além da atividade da toxina Cry2Aa demonstrada ser efetiva contra o inseto-praga em questão; atividades entomotóxicas essas sujeitas à proteção sob a forma de patente. Os resultados aqui apresentados serão utilizados para a construção de vetores de expressão em plantas para uso na transformação genética de cana-de-açúcar, visando a resistência à broca gigante da cana-de-açúcar.In Brazil, the sugarcane crops (Saccharum officinarum) have great eraphasis, with approximately 40% world production. It presents estimated production about 571 million tonnes for the 2011/2012 harvest, with an interesting and environmentally friendly altemative for the production of renewable energy sources. Although Brazil i ranked among the world’s leading producers of sugarcane, regions like the Northeast and Southeast have economic problems related to damage caused by the attack of insect pests, especially the sugarcane giant borer (Telchin licus licus) (Lepidoptera: Castniidae) and sugarcane borer (Diatraea saccharalis) (Lepidoptera: Crambidae), respectively. The difficulty in controlling these pests is the fact that they have endophytic habit, blocking the chemical insecticides action. In this context, several entomotoxic proteins have been described as potential candidates for the control of insect pests. Cry toxins or ô-endotoxins secreted by Gram-positive bacterium Bacillus thuringiensis (Bt) are effectively used to control insect pests because of their specificity and toxicity of some insect orders. In this work, the goal is creating and selecting Cry toxins effective against T. I. licus, using the DNA shuffling and Phage display molecular techniques. Bioassays results using Bt strains (Bt sor. kurstaki S2195 and SI905 and Bt sor. tolworthi SI35 and S62) and l st instar T. I. licus larvae showed high mortality in treatments with Bt sor. kurstaki. The cry genes were present in that serovars were determined and osmotic swelling assays based on light scattering indicated that CrylAa, CrylAb, CrylAc, Cryllal2 and Cry2Aa toxins were able to form pores in T. I. licus BBMVs. In bioassays with the same Cry toxins (1 mg/mL) and T. I. licus larvae, effectiveness was demonstrated, with a mortality rate of approximately 90%. In order to obtain new molecules for in vitro molecular evolution application, nucleotide sequences analysis between crylAa, cryllal2 and cry2Aa was held and the first two were chosen to be recombined by this technique therefore have higher nucleotide identity. After DNA shuffling, a combinatorial library was obtained containing 1.36 x 106 variant crylAa and cryllal2 genes. Before start selecting Cry variants using Phage display (biopanning), the receptors present in sugarcane giant borer midgut membranes (BBMVs) were tested for their quality and exhibited enrichment from 7.0 to 13.5-fold relative to marker enzymes tested. We selected five genes showing affmity to T. I. licus BBMVs. These were expressed in E. coli, validated by bioassays and BBMVs binding assays. We identified two variant Cryllal2 toxins exhibiting increased activity of 2.5 to 3.5 times compared to wild toxin; further the Cry2Aa toxin activity showed to be effective against the insect pest in question, activities subject to protection under patent. The results presented here will be used for the expression vectors construction in sugarcane genetic transformation, in order to resistance to sugarcane giant borer.Sá, Maria Fátima Grossi deFreitas, Sônia Maria deGomes Júnior, José Edilson2020-01-15T18:46:07Z2020-01-15T18:46:07Z2020-01-152012-02info:eu-repo/semantics/publishedVersioninfo:eu-repo/semantics/doctoralThesisapplication/pdfGOMES JÚNIOR, José Edilson. Toxinas Cry: potencial uso no controle da broca gigante da cana-de-açúcar (Telchin licus licus). 2012. [123] f., il. Tese (Doutorado em Biologia Molecular)—Universidade de Brasília, Brasília, 2012.https://repositorio.unb.br/handle/10482/36115A concessão da licença deste item refere-se ao termo de autorização impresso assinado pelo autor com as seguintes condições:Na qualidade de titular dos direitos de autor da publicação, autorizo a Universidade de Brasília e o IBICT a disponibilizar por meio dos sites www.bce.unb.br, www.ibict.br, http://hercules.vtls.com/cgi-bin/ndltd/chameleon?lng=pt&skin=ndltd sem ressarcimento dos direitos autorais, de acordo com a Lei nº 9610/98, o texto integral da obra disponibilizada, conforme permissões assinaladas, para fins de leitura, impressão e/ou download, a título de divulgação da produção científica brasileira, a partir desta data.info:eu-repo/semantics/openAccessporreponame:Repositório Institucional da UnBinstname:Universidade de Brasília (UnB)instacron:UNB2023-07-08T00:05:38Zoai:repositorio.unb.br:10482/36115Repositório InstitucionalPUBhttps://repositorio.unb.br/oai/requestrepositorio@unb.bropendoar:2023-07-08T00:05:38Repositório Institucional da UnB - Universidade de Brasília (UnB)false
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