Xanthomonas citri pv. viticola : detecção, diversidade de efetores e interação com hospedeiras alternativas

Detalhes bibliográficos
Autor(a) principal: Villela, João Gilberto Alves
Data de Publicação: 2019
Tipo de documento: Tese
Idioma: por
Título da fonte: Repositório Institucional da UnB
Texto Completo: http://repositorio2.unb.br/jspui/handle/10482/47554
Resumo: Tese (doutorado) — Universidade de Brasília, Instituto de Ciências Biológicas, Departamento de Fitopatologia, Programa de Pós-Graduação em Fitopatologia, 2019.
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spelling Xanthomonas citri pv. viticola : detecção, diversidade de efetores e interação com hospedeiras alternativasXanthomonas citri pv. viticola : detection, diversity of effectors and interaction with alternative hostsCancro bacterianoVideira (Vitis vinifera L.)DiagnoseTese (doutorado) — Universidade de Brasília, Instituto de Ciências Biológicas, Departamento de Fitopatologia, Programa de Pós-Graduação em Fitopatologia, 2019.O cancro bacteriano da videira, causado por Xanthomonas citri pv. viticola (Xcv), é a doença de maior preocupação entre os viticultores da região do Submédio do Vale do São Francisco, sendo responsável por quedas expressivas na produção, principalmente em variedades de uvas finas para mesa. Devido à sua ocorrência restrita e por representar risco ao desenvolvimento da viticultura nacional, o agente etiológico da doença é regulamentado como uma Praga Quarentenária Presente (PQP). Os objetivos principais deste estudo foram: (i) estabelecer protocolos de detecção molecular de Xcv em videiras assintomáticas via PCR em tempo real (qPCR), (ii) investigar aspectos da interação entre Xcv e hospedeiras alternativas e (iii) caracterizar o repertório de genes efetores do tipo III (T3Es) em Xcv. Para o desenvolvimento de protocolos de detecção molecular, foram desenhados e selecionados dois novos pares de primers, tendo como alvos sequências do gene de patogenicidade hrpB (Xcv18F/19R) e do cluster referente à síntese do pigmento xantomonadina (Xpig2F/1R). O par Xcv18F/19R apresentou especificidade limitada, mas foi eficiente para uso tanto em PCR convencional (cPCR) quanto em qPCR, enquanto o par Xpig2F/1R foi altamente específico para Xcv, mas mostrou baixa eficiência no formato qPCR. O limiar de detecção de Xcv em material vegetal foi determinado por extração de DNA total e enriquecimento das amostras em meio semisseletivo seguido de cPCR com os dois pares de primers selecionados e qPCR apenas com o par Xcv18F/19R. Para tanto, foram preparados extratos de folhas de videira com concentrações de inóculo variando de 107 a 1 UFC ml-1. Utilizando a etapa prévia de enriquecimento das amostras em meio de cultura observou-se um aumento de 10 vezes na sensibilidade, quando comparado com a extração de DNA total. A maior sensibilidade foi obtida no formato qPCR, detectando-se uma concentração inicial de 10 UFC ml-1. Em condições de infecção natural no campo, amostras de videiras sintomáticas e assintomáticas foram testadas por dois protocolos: qPCR com o par de primers Xcv18F/19R e cPCR com o par Xpig2F/1R. Nos dois casos empregou-se o enriquecimento prévio dos extratos em meio de cultura por 36-72h. Com ambos protocolos, detectou-se a presença de Xcv em todas as amostras sintomáticas. Nas amostras assintomáticas, a bactéria foi detectada em 93,4% por qPCR e em 89,5% por cPCR. Os protocolos desenvolvidos neste estudo apresentam vantagens quanto à especificidade e sensibilidade, sendo ferramentas valiosas para a detecção e identificação de Xcv em diferentes situações, tanto para fins de pesquisa quanto para rotinas de inspeção fitossanitária. Estudos de interação de Xcv com hospedeiras alternativas foram conduzidos para investigar a capacidade de colonização e translocação vascular do patógeno em Senna obtusifolia, e em espécies da família Amaranthaceae (Amaranthus cruentus, A. spinosus, Chenopodium giganteum e C. quinoa). Ensaios de dinâmica populacional demostraram que Xcv foi capaz de colonizar plantas de todas as cinco espécies avaliadas, além de sobreviver epifiticamente, por pelo menos 20 dias, em populações altas em folhas de S. obtusifolia. A capacidade de translocação vascular foi avaliada por inoculação do patógeno em caule e posterior detecção por BIO-PCR. Em plantas de S. obtusifolia, foi avaliada a translocação acropetal e basipetal, e em plantas da família Amaranthaceae, apenas a translocação acropetal. Resultados sugerem que Xcv é capaz de colonizar de forma sistêmica todas as espécies avaliadas. Para caracterizar o repertório de genes T3Es em Xcv, foram realizadas análises in silico nos três genomas disponíveis, pertencentes a dois isolados brasileiros (CCRMXCV 80 e CFBP 7764) e o patotipo indiano (LMG 965). Como resultado, foi identificado um repertório único de 27 genes. Porém, ao analisar as sequências de cada gene, foi observado uma deleção de um nucleotídeo no gene xopAD do patotipo indiano, resultando em uma proteína truncada. A distribuição de 29 genes T3Es de Xanthomonas spp., incluindo 20 dos genes detectados nos três genomas de Xcv, foi determinada por PCR em uma coleção de 68 isolados de Xcv. A diversidade de virulência dos isolados de Xcv em videira também foi avaliada com o objetivo de investigar possível correlação com a presença dos genes T3Es. Os resultados de PCR revelaram a presença de 22 genes T3Es em todos os isolados de Xcv, em contraste com uma alta diversidade de virulência em videira entre os isolados.Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior (CAPES) e Conselho Nacional de Desenvolvimento Científico e Tecnológico (CNPq).Grapevine bacterial canker, caused by Xanthomonas citri pv. viticola (Xcv), is one of the most important diseases concerning table grape production in Submédio do Vale do São Francisco region, in Brazil. Because of its restricted geographical occurrence and the risk to the development of national viticulture, Xcv is regulated as a Present Quarantine Pest. The main objectives of this study were: (i) to develop molecular detection protocols of Xcv in asymptomatic grapevines via real-time PCR (qPCR), (ii) to investigate the interaction between Xcv and alternative hosts and (iii) to characterize the repertoire of type III effector genes (T3Es) in Xcv. For the development of molecular detection protocols, two new pairs of primers were designed and selected, having as targets sequences of the pathogenicity gene hrpB (Xcv18F/19R) and the xanthomonadin-coding cluster (Xpig2F/1R). The Xcv18F/19R primers showed limited specificity, but were efficient for use in both cPCR and qPCR, while Xpig2F/1R primers were highly specific for Xcv, but showed low efficiency in the qPCR format. The detection limit of Xcv in plant material was determined by total DNA extraction and sample enrichment in semi-selective medium followed by cPCR with the two selected primer pairs and qPCR with Xcv18F/19R. Grapevine leaf extracts spiked with bacterial suspensions at concentrations ranging from 107 to 1 CFU ml-1 were prepared. Enrichment of plant extracts in semi-selective culture medium before PCR allowed a significant increase (10x) in sensitivity when compared to total DNA extraction protocol, making it possible to detect as low as 10 CFU ml-1. Under natural infection conditions, samples of symptomatic and asymptomatic grapevines were tested by two protocols: qPCR with primers hrpB and cPCR with xanthomonadin primers. In both cases, the plant extracts were enriched in culture medium for 36-72h. Xcv was detected in all symptomatic samples, and the result was confirmed by cPCR with the more specific primers Xpig2F/1R. For the asymptomatic samples, Xcv was detected in 93.4% with qPCR and in 89.5% of the samples with cPCR. These two protocols offer advantages in terms of sensitivity and specificity, being valuable tools for detection and identification of Xcv in different situations, both for research purposes and for phytosanitary inspection routines. The colonization ability and vascular translocation of Xcv on alternative hosts was investigated by pathogenicity assays in Senna obtusifolia, and in species of the Amaranthaceae family (Amaranthus cruentus, A. spinosus, Chenopodium giganteum and C. quinoa). Population dynamics assays showed that Xcv was able to colonize all plant species evaluated, and also to survive epiphytically for at least 20 days in high populations on leaves of S. obtusifolia. The ability to invade plant tissues systemically was evaluated by stem inoculation and subsequent detection by BIO-PCR. For S. obtusifolia acropetal and basipetal translocation was detected, but only acropetal translocation was observed in Amaranthaceae plants. Xcv translocated in all plants evaluated, indicating that colonization may occur systemically. To characterize the repertoire of T3Es genes in Xcv, in silico analysis were performed with the three available whole genomes, from two Brazilian strains (CCRMXCV 80 and CFBP 7764) and the Indian pathotype (LMG 965). As a result, a unique repertoire of 27 genes was identified. However, by analyzing the sequences of each gene, a deletion of a nucleotide in the xopAD gene of the Indian pathotype was observed, resulting in a truncated protein. The distribution of 29 T3Es from Xanthomonas spp., including 20 genes detected in the three Xcv genomes, was determined by PCR in a collection of 68 Xcv strains. The virulence of Xcv strains in grapevine was also evaluated in order to investigate a possible correlation with the distribution of T3Es genes. PCR results revealed the presence of 22 T3Es genes in all Xcv strains, in contrast, higher diversity virulence on grapevine leaves among strains was detected.Instituto de Ciências Biológicas (IB)Departamento de Fitopatologia (IB FIT)Programa de Pós-Graduação em FitopatologiaFerreira, Marisa Alvares da Silva VellosoVillela, João Gilberto Alves2024-01-28T18:09:03Z2024-01-28T18:09:03Z2024-01-282019-07-11info:eu-repo/semantics/publishedVersioninfo:eu-repo/semantics/doctoralThesisapplication/pdfVILLELA, João Gilberto Alves. Xanthomonas citri pv. viticola: detecção, diversidade de efetores e interação com hospedeiras alternativas. 2019. 164 f., il. Tese (Doutorado em Fitopatologia) — Universidade de Brasília, Brasília, 2019.http://repositorio2.unb.br/jspui/handle/10482/47554porinfo:eu-repo/semantics/openAccessreponame:Repositório Institucional da UnBinstname:Universidade de Brasília (UnB)instacron:UNB2024-01-28T18:09:03Zoai:repositorio.unb.br:10482/47554Repositório InstitucionalPUBhttps://repositorio.unb.br/oai/requestrepositorio@unb.bropendoar:2024-01-28T18:09:03Repositório Institucional da UnB - Universidade de Brasília (UnB)false
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