Avaliação funcional e estrutural da interação entre a quinase de adesão focal e a miosina sarcomérica

Detalhes bibliográficos
Autor(a) principal: Santos, Aline Mara dos, 1982-
Data de Publicação: 2011
Tipo de documento: Tese
Idioma: por
Título da fonte: Biblioteca Digital de Teses e Dissertações da Universidade Estadual de Campinas (UNICAMP)
Texto Completo: https://hdl.handle.net/20.500.12733/1615033
Resumo: Orientador: Kleber Gomes Franchini
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No presente trabalho foi demonstrado que o domínio FERM da FAK medeia à interação com a miosina sarcomérica, sendo que esta interação leva a inibição da autofosforilação da FAK, enquanto que a ativação prévia da FAK reduz sua interação com a miosina in vitro. Ensaios de cross linking acoplado a espectrometria de massas e espalhamento de raios X a baixos ângulos demonstraram que a miosina interage em uma fenda localizada entre os subdomínios do domínio FERM. Experimentos de microscopia confocal demonstraram que estas proteínas estão colocalizadas em miócitos cardíacos de ratos neonatos e adultos. Ensaios de imunoprecipitação revelaram que aproximadamente 40% da FAK está basalmente associada à miosina sarcomérica enquanto que, após o estiramento celular esta associação reduziu paralelamente à ativação da FAK. A porcentagem de FAK associada à miosina não se alterou com a ativação da FAK após tratamento com fenilefrina, diferente da ativação pelo estresse mecânico. A interferência na interação FAK/miosina pelo silenciamento gênico da miosina culminou com a ativação da FAK e o tratamento dos miócitos cardíacos com o peptídeo FP-1, derivado do subdomínio F2 do domínio FERM, levou a uma diminuição na interação FAK/miosina e ao aumento na fosforilação/ativação da FAK. O tratamento prolongado com FP-1 resultou em hipertrofia dos miócitos cardíacos de ratos neonatos, efeito concomitante à ativação da via de sinalização Akt, TSC2 e S6Kinase. Tanto o silenciamento da FAK quanto o tratamento com rapamicina bloquearam a hipertrofia decorrente do tratamento com FP-1. Os dados deste trabalho indicam que a interação da FAK com a miosina sarcomérica é sensível ao estresse mecânico e que possui papel regulatório na manutenção da quiescência basal da FAK e no controle das vias de sinalização mediadas por esta quinase, como a via de crescimento celular AKT/mTOR/S6Kinase, em miócitos cardíacos em culturaAbstract: The Focal Adhesion Kinase (FAK) plays a critical role in mediating the migration, survival and cell proliferation. Previous studies from our laboratory demonstrated that FAK is activated by mechanical stress in cardiac myocytes and it co-immunoprecipitate with sarcomeric myosin. Here, we demonstrated that the FAK FERM domain mediates the interaction with sarcomeric myosin, and that this interaction leads to inhibition of FAK autophosphorylation in vitro, whereas the previous activation of FAK reduces its affinity to myosin. A model based on small angle X-ray scattering analyses and crosslinking technology coupled with mass spectrometry indicated that a cleft in FERM domain is critical to the interaction of FAK to myosin. Confocal microscopy experiments showed that these proteins are colocalized in cardiomyocytes of neonatal and adult rats. Immunoprecipitation assays revealed that approximately 40% of FAK is basally associated with sarcomeric myosin while cardiomyocyte stretching reduced this association in parallel with FAK activation. The percentage of FAK associated with myosin was not change in response to FAK activation by treatment with phenylephrine, unlike in response to FAK by mechanical stress. The interference in the FAK/Myosin interaction by myosin silencing approach culminated with the activation of FAK. The treatment of cells with the FP-1 peptide, derived from the FAK FERM domain, lead to a decrease in the interaction with sarcomeric myosin and an increase in FAK activation. Prolonged treatment with FP-1 resulted in morphological hypertrophy of neonatal rat cardiomyocytes which was an effect concomitant with activation of the Akt, TSC2 and S6Kinase signaling pathway. Both FAK silencing and the rapamycin treatment blocked the morphological hypertrophy resulting of the treatment with FP-1. This study indicated that the interaction of FAK with sarcomeric myosin is sensitive to mechanical stress and it has regulatory role in maintaining of FAK quiescence and control of signaling pathways mediated by this kinase, such as cell growth via AKT/mTOR/S6Kinase in cardiac myocytes in cultureDoutoradoBiologia Estrutural, Celular, Molecular e do DesenvolvimentoDoutor em Ciências[s.n.]Franchini, Kleber Gomes, 1961-De Nucci, GilbertoLourenço, Luciana BolsoniGomes, Marcelo DamarioAmbrosio, Andre Luís BerteliUniversidade Estadual de Campinas. Faculdade de Ciências MédicasPrograma de Pós-Graduação em CiênciasUNIVERSIDADE ESTADUAL DE CAMPINASSantos, Aline Mara dos, 1982-2011info:eu-repo/semantics/publishedVersioninfo:eu-repo/semantics/doctoralThesisapplication/pdf165 p. : il.https://hdl.handle.net/20.500.12733/1615033SANTOS, Aline Mara dos. Avaliação funcional e estrutural da interação entre a quinase de adesão focal e a miosina sarcomérica. 2011. 165 p. Tese (doutorado) - Universidade Estadual de Campinas, Faculdade de Ciências Médicas, Campinas, SP. Disponível em: https://hdl.handle.net/20.500.12733/1615033. 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