Identificação e caracterização de chaperones de secreção no genoma do fitopatógeno Xanthomonas axonopodis patovar citri

Detalhes bibliográficos
Autor(a) principal: Khater, Letícia, 1978-
Data de Publicação: 2006
Tipo de documento: Tese
Idioma: por
Título da fonte: Biblioteca Digital de Teses e Dissertações da Universidade Estadual de Campinas (UNICAMP)
Texto Completo: https://hdl.handle.net/20.500.12733/3306
Resumo: Orientador: Carlos Henrique Inacio Ramos
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spelling Identificação e caracterização de chaperones de secreção no genoma do fitopatógeno Xanthomonas axonopodis patovar citriIdentification and characterization of secretion chaperones in the phytopathogen Xanthomonas axonopodis patovar citriChaperonas molecularesFlagelos (Microbiologia)XanthomonasMolecular chaperonesFlagella (Microbiology)Orientador: Carlos Henrique Inacio RamosTese aguardando autorização para liberação do texto completo no Repositório da Produção Científica e Intelectual da UNICAMPTese (doutorado) - Universidade Estadual de Campinas, Instituto de BiologiaResumo: A anotação automática de genes através do sequenciamento completo do genoma de um patógeno possibilita estudar e compreender a biologia e os mecanismos de infecção, proporcionando sistemas de controle e tratamento de pragas e doenças. Genes são anotados por homologia e as informações gerais obtidas fornece indicações sobre a filognia do organismo, organização dos genes, vias metabólicas, etc. A análise cuidadosa desta anotação é necessária para identificar e caracterizar proteínas que não possuem homologia com organismos já seqüenciados e ficam anotadas como proteínas hipotéticas. Dentre estas, encontram-se as proteínas responsáveis pelo auxílio da translocação de outras proteínas, designadas chaperones de secreção, as quais não possuem homologia com bactérias e, portanto, não foram identificadas no fitopatógeno Xanthomonas axonopodis pv. citri (Xac). Os genes, que possivelmente codificam estas chaperones, foram selecionados do genoma do patógeno com base nas características comuns às chaperones desta família. Este trabalho objetivou identificar, dentre as proteínas denominadas hipotéticas, quais poderiam ser chaperones de secreção através da interação protéica observada com a metodologia de duplo-híbrido. A biblioteca de duplo-híbrido foi gerada a partir de 40 possíveis genes de chaperones de secreção selecionados. Esta biblioteca foi co-transformada com a biblioteca de fragmentos de todos os genes de Xac, possibilitando a identificação de interações entre possíveis chaperones de secreção e outras proteínas desta bactéria. Dentre estas foram selecionadas 6 proteínas para clonagem dos respectivos cDNAs em vetor de expressão da família pET: A hipotética chaperone flagelar XAC1990 (15046.1) e a proteína exportada FlgK; XAC1977 (6776.1), as hipotéticas XACb0033 (10073.2) e XACb0032 (11005.1) pertencentes ao sistema secretório tipo IV, a hipotética chaperone XACa0025 (10039.1) e a transposase XAC3248 (40041.17). As proteínas XACb0032 (11005.1), XACa0025 (10039.1) e a transposase XAC3248 (40041.17) permaneceram insolúveis após expressão e tentativas de ressolubilização. Já a proteína XACb0033 (10073.2), foi purificada e caracterizada sendo realizado ensaios de cristalização com a mesma. A possível chaperone flagelar XAC1990 (15046.1), FlgN e a proteína exportada FlgK também foram purificadas e caracterizadas além de ser confirmada in vitro a interação obtida por duplo-híbrido em levedura (in vivo). Apenas FlgK foi submetida a ensaios de cristalização, uma vez que XAC1990 degrada-se em poucos dias após purificação. Para a caracterização destas duas proteínas, foram utilizadas técnicas biofísicas como o dicroísmo circular e fluorescência do triptofano. Estas técnicas possibilitaram a caracterização da estrutura secundária das proteínas e sua estabilidade térmica. Através dos experimentos de desenovelamento térmico foi constatado que a desnaturação térmica é parcialmente irreversível para as duas proteínas. Estes experimentos caracterizaram a estabilidade das proteínas, mas não foram adequados para confirmar a interação observada pelo duplo-híbrido. Todavia, a confirmação in vitro do resultado obtido in vivo foi possível através do resultado de gel filtração analítica e do ensaio de co-preciptação (¿pull down¿). A conclusão final é a identificação de uma proteína hipotética em Xanthomonas axonopodis pv. citri sendo que, por homologia, também poderão ser identificadas as proteínas de Xanthomonas oryzae pv. oryzae, Xanthomonas campestris pv. campestris e Xanthomonas campestris pv. vesicatoria como FlgNAbstract: The complete sequencing of a genome is a powerful method to investigate the biology of this organism and an automatic gene annotation is a valid tool to an initial investigation of the sequenced genome. Genes are annotated by homology and the global picture provided gives enormous information about the organism phylogeny, genome organization, metabolic pathways, etc. The genome sequence of the phytopathogen Xanthomonas axonopodis pv. citri made open the possibility to understand its biology and its mechanisms of infection, which will help to provide systems of control and treatment of plagues and illnesses. The careful analysis of the annotation is necessary to identify proteins that do not present homology among the genes already sequenced and therefore were labeled as hypothetical. Amongst these, are the proteins that assist the translocation of other proteins, designed secretion chaperones, which were not identified in the phytopathogen Xanthomonas axonopodis. We took to identify such proteins. First, a two-hybrid library was made from a previous set of 40 genes identified as potential secretion chaperones in the Xanthomonas axonopodis genome, which were selected by bioinformatics based on the common characteristics of chaperones from this family. This library was co-transformed with a Xanthomonas axonopodis genomic library allowing the identification of interactions between potential secretion chaperones and other proteins of this bacterium. Second, the most interesting interactions were selected and the cDNA of six proteins were cloned into pET-based plasmids for recombinant production: the hypothetical flagellar chaperone XAC1990 (15046.1) and its substrate FlgK; XAC1977 (6776.1), the hypothetical proteins XACb0033 (10073.2) and XACb0032 (11005.1) that belong to the type four secretion system, the hypothetical protein XACa0025 (10039.1) and the transposase XAC3248 (40041.17). Proteins XACb0032 (11005.1), XACa0025 (10039.1) and the transposase XAC3248 (40041.17) were produced insoluble, impairing their purification. Protein XACb0033 (10073.2) was purified soluble and crystallization trials were set up. The potential flagellar chaperone XAC1990 (15046.1), FlgN, and its substrate FlgK were also purified and characterized. Crystallization trials were set up only for FlgK but not for FlgN because of self-degradation, which happens in within few days. The interaction observed in vivo (by two hybrid assay) was confirmed in vitro (by analytical gel filtration and pull down assays) and the conformational state of the proteins was characterized by spectroscopy experiments (circular dichroism and emission fluorescence of the tryptophan). These experiments lead to the identification of FlgN in Xanthomonas axonopodis pv. citri, and by homology also in Xanthomonas oryzae pv. oryzae, Xanthomonas campestris pv. campestris e Xanthomonas campestris pv. vesicatoria. Soundly, such identification represents an initial step to clarify the biology of flagellar formation in XanthomonasDoutoradoBioquímicaDoutor em Biologia Funcional e Molecular[s.n.]Ramos, Carlos Henrique Inacio, 1967-Novello, Jose CamilloPereira, Gonçalo Amarante GuimarãesVincentz, Michel Georges AlbertAraujo, Ana Paula Ulian deUniversidade Estadual de Campinas (UNICAMP). Instituto de BiologiaPrograma de Pós-Graduação não informadoUNIVERSIDADE ESTADUAL DE CAMPINASKhater, Letícia, 1978-20062006-10-02T00:00:00Zinfo:eu-repo/semantics/publishedVersioninfo:eu-repo/semantics/doctoralThesisapplication/pdf166 p. : il.https://hdl.handle.net/20.500.12733/3306KHATER, Letícia. Identificação e caracterização de chaperones de secreção no genoma do fitopatógeno Xanthomonas axonopodis patovar citri. 2006. 166 p. Tese (doutorado) - Universidade Estadual de Campinas, Instituto de Biologia, Campinas, SP. Disponível em: https://hdl.handle.net/20.500.12733/3306. Acesso em: 2 set. 2024.https://repositorio.unicamp.br/acervo/detalhe/362453porreponame:Biblioteca Digital de Teses e Dissertações da Universidade Estadual de Campinas (UNICAMP)instname:Universidade Estadual de Campinas (UNICAMP)instacron:UNICAMPinfo:eu-repo/semantics/openAccess2022-09-29T13:06:59Zoai::362453Biblioteca Digital de Teses e DissertaçõesPUBhttp://repositorio.unicamp.br/oai/tese/oai.aspsbubd@unicamp.bropendoar:2022-09-29T13:06:59Biblioteca Digital de Teses e Dissertações da Universidade Estadual de Campinas (UNICAMP) - Universidade Estadual de Campinas (UNICAMP)false
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