Purificação e caracterização da arilsulfatase A de parotida bovina

Detalhes bibliográficos
Autor(a) principal: Nakamune, Ana Claudia de Melo Stevanato
Data de Publicação: 2002
Tipo de documento: Tese
Idioma: por
Título da fonte: Biblioteca Digital de Teses e Dissertações da Universidade Estadual de Campinas (UNICAMP)
Texto Completo: https://hdl.handle.net/20.500.12733/1592362
Resumo: Orientadores: Jose Mauro Granjeiro, Eulazio Mikio Taga
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spelling Purificação e caracterização da arilsulfatase A de parotida bovinaGlândulas salivaresGlândula parótidaOrientadores: Jose Mauro Granjeiro, Eulazio Mikio TagaTese (doutorado) - Universidade Estadual de Campinas, Instituto de BiologiaResumo: A arilsulfatase A de parótida bovina foi purificada 6.614 vezes, até homogeneidade, através de fracionamento com sulfato de amônio, precipitação ácida, precipitação cetônica, cromatografia de troca iônica (DEAE-Sephadex A50) e cromatografia de exclusão molecular (Sephacryl S-200). O rendimento obtido foi de 35,1% e a atividade específica foi de 79,4 UElmg. A pureza da enzima foi comprovada através de eletroforese em condição nativa (PAGE) e desnaturante (SDS-PAGE), e cromatografia de exclusão molecular (Sephacryl S-200). Como determinado através de filtração em gel e SDS-PAGE, a enzima apresentou uma Mr de 135,0 e 60,5 kDa, respectivamente. Os estudos cinéticos demonstraram que a temperatura ótima para a enzima é de 40°C e que a 70°C e 20°C, existia atividade enzimática residual de 28,5% e 44,0 %, respectivamente. Quanto ao pH ótimo, foi observado um platô entre o pH 4,5 e o pH 5,5. A KM obtida para o p-NCS foi de 1,1 mmol L-1, a VMax 241,6 IJmol min-1, a constante catalítica 806,0 S-1 e a energia de ativação 13,583 kcal rroI-1. A enzima foi fortemente inibida por prata (Ki 0,4x10-6 moi L-1) e fosfato (Ki 2,95x10-6 moi L-1), mas insensível ao bário, chumbo, cl o reto , nitrato e sulfatoAbstract: Arylsulfatase A from bovine parotid was purified 6,614-fold to homogeneity, by procedures involving ammonium sulfate fractionation, acid treatment, acetone preciptation, DEAE-Sephadex ion-exchange chromatography and Sephacryl S-200 gel filtration. The enzyme recovery was 35.1 % and specific activity 79.4 units per mg protein. The following homogeneity criteria were used: PAGE, SDS-PAGE and gel filtration on Sephacryl-S200. The relative molecular mass of 135.0 (dimer) and 60.5 kDa (monomer) were determined by gel filtration chromatography and SDSPAGE, respectively. Kinectic studies showed an optimum temperature of 40° C, and a broad optimum pH between 4.5-5.5. The I<M value of 1.1 mmol L -1 was obtained, a VMax 241.6 IJmol L-1, and kcat 806.0 S-1 for p-NCS and activation energy 13.583 kcal mor1. The enzyme was inhibited by silver (Ki 0.4x10-6 moi L-1) and phosphate (Ki 2.95x10-6 moi L-1) but was not inhibited by barium, lead, nitrate and sulfateDoutoradoBioquímicaDoutor em Biologia Funcional e Molecular[s.n.]Granjeiro, Jose MauroTaga, Eulazio MikioSassaki, Kikue TakebayashiCiancaglini, PietroOgo, Satie HatsushikaMarangoni, SergioUniversidade Estadual de Campinas. Instituto de BiologiaPrograma de Pós-Graduação não informadoUNIVERSIDADE ESTADUAL DE CAMPINASNakamune, Ana Claudia de Melo Stevanato20022002-07-17T00:00:00Zinfo:eu-repo/semantics/publishedVersioninfo:eu-repo/semantics/doctoralThesisapplication/pdf79p. : il.(Broch.)https://hdl.handle.net/20.500.12733/1592362NAKAMUNE, Ana Claudia de Melo Stevanato. Purificação e caracterização da arilsulfatase A de parotida bovina. 2002. 79p. Tese (doutorado) - Universidade Estadual de Campinas, Instituto de Biologia, Campinas, SP. Disponível em: https://hdl.handle.net/20.500.12733/1592362. Acesso em: 14 mai. 2024.https://repositorio.unicamp.br/acervo/detalhe/243168porreponame:Biblioteca Digital de Teses e Dissertações da Universidade Estadual de Campinas (UNICAMP)instname:Universidade Estadual de Campinas (UNICAMP)instacron:UNICAMPinfo:eu-repo/semantics/openAccess2017-02-18T03:36:43Zoai::243168Biblioteca Digital de Teses e DissertaçõesPUBhttp://repositorio.unicamp.br/oai/tese/oai.aspsbubd@unicamp.bropendoar:2017-02-18T03:36:43Biblioteca Digital de Teses e Dissertações da Universidade Estadual de Campinas (UNICAMP) - Universidade Estadual de Campinas (UNICAMP)false
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