Diferentes processos de armazenamento de levedura : estudos sobre a variabilidade fenotipica e genotipica

Detalhes bibliográficos
Autor(a) principal: Sant'Ana, Priscilla de Laet, 1974-
Data de Publicação: 2006
Tipo de documento: Tese
Idioma: por
Título da fonte: Biblioteca Digital de Teses e Dissertações da Universidade Estadual de Campinas (UNICAMP)
Texto Completo: https://hdl.handle.net/20.500.12733/1602047
Resumo: Orientador: Jose Francisco Hofling
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spelling Diferentes processos de armazenamento de levedura : estudos sobre a variabilidade fenotipica e genotipicaDifferent procedures for yeast stock collection : phenotype and genotype diversity studyLeveduras (Fungos)FenótipoGenótipoCriopresevaçãoYeast fungiPhenotypeGenotypeCryopresevationOrientador: Jose Francisco HoflingTese (doutorado) - Universidade Estadual de Campinas, Faculdade de Odontologia de PiracicabaResumo: A preservação de microrganismos é um importante recurso para a manutenção e conservação de espécies microbianas em laboratórios clínicos, técnicos e de pesquisa. Diferentes métodos de armazenamento de espécies de leveduras em laboratório foram descritos, objetivando principalmente, melhores resultados quanto à manutenção da viabilidade e das propriedades celulares por tempos prolongados. Métodos ideais de armazenamento de leveduras e outros microrganismos necessitam promover a sobrevida das células, bem como a pureza da cultura e a estabilidade de suas características. Alguns pesquisadores, no entanto, têm mencionado a ocorrência de alterações fenotípicas e/ou genotípicas em amostras mantidas em laboratório, as quais podem influenciar estudos, tipagem e a aplicabilidade destes organismos nos diversos setores. Há, portanto, uma necessidade de estudos adicionais que avaliem a estabilidade das propriedades das amostras de leveduras após serem mantidas em laboratório por diferentes métodos. Assim, o objetivo desta pesquisa foi avaliar a influência de métodos de manutenção laboratorial de leveduras sobre as suas características morfológicas e bioquímicas. Para isso, foram testadas seis cepas padrão de leveduras do gênero Candida, sendo quatro espécies de interesse médico e duas de interesse industrial, submetidas a cinco diferentes métodos de armazenamento, a saber: transferências seriadas em meio sólido, óleo mineral, água destilada, congelamento em glicerol a -70ºC e liofilização. As amostras foram caracterizadas fenotipicamente antes de serem armazenadas, e após o armazenamento em diferentes intervalos de tempos por um período de 18 meses. Foram avaliadas as características das colônias em meio CHROMagar Candida®, micromorfologia em ágar fubá, assimilação e fermentação de carboidratos, produção de proteinases e fosfolipases, teste de crescimento a 45°C e crescimento em meio hipertônico. O DNA das amostras foi extraído nos tempos zero, 06, 12 e 18 meses, para análise genotípica por Randomly Amplified Polymorphic DNA (RAPD), utilizando-se dois diferentes primers para cada cepa. Os resultados obtidos mostraram que todos os métodos de conservação avaliados permitiram a manutenção da viabilidade das amostras durante todo o período analisado (18 meses). A exceção ocorreu com a amostra de Candida dubliniensis que perdeu sua viabilidade em óleo mineral após 12 meses de conservação. Não foram observadas alterações fenotípicas nos resultados dos testes morfológicos e bioquímicos, após a preservação laboratorial através de todos os métodos utilizados no estudo. Entretanto, variações não estáveis foram observadas para algumas amostras nos testes de produção de fosfolipases e proteinases, e para o crescimento em meio hipertônico. Tais variações não estavam relacionadas com uma condição específica de manutenção da cepa e o resultado alterado foi reversível em testes subseqüentes. Alterações no padrão de RAPD não foram detectadas em pelo menos duas reações independentes para cada um dos primers testados. Os resultados obtidos demonstram que os métodos de conservação aplicados neste estudo permitem a manutenção da estabilidade das características fenotípicas e genotípicas relacionadas aos testes aplicados, em amostras de leveduras preservadas durante o período avaliado. Desta forma, a aplicabilidade do ponto de vista técnico ou de pesquisa não é inviabilizada para amostras preservadas por estes métodos. Cepas destinadas ao uso em finalidades específicas devem ser testadas individualmente quanto ao método de conservação mais indicadoAbstract: The maintenance of microorganisms is useful to preserve microbial species in clinical, technical and research laboratories. Different methods to yeast stocking are available in order to obtain long time viability and stability of cell properties. The best methods to store microorganisms need to provide the cell survival as well as purity and stability of their properties. Some researches, however, have mentioned phenotypic and/or genotytpic changes in laboratorial samples, which may influence yeast typing, studies and the applications of those organisms in different areas. Therefore, additional studies are needed to evaluate the yeast samples properties stability after stocking through different methods. The aim of this study was to evaluate the influence of the yeast storage methods in terms of their morphological and biochemistry characteristics. Candida spp. standard strains, four of medical importance and two industrial species were evaluated. Those strains were submitted to five storage methods: serial transferences in agar medium, mineral oil, distilled water, freeze with glycerol at -70ºC and freeze-drying. The samples were characterized with phenotypic techniques before being stocked, and after that in different periods of time up to 18 months. It was tested the characteristics of the colonies in CHROMagar Candida® medium, micromorphology in corn meal agar, carbohydrates assimilation and fermentation, phospholipases and proteinases production in solid medium, growth test in 45ºC and growth test in hypertonic medium. In addition, the DNA extraction of all samples was carried out in time zero, 6, 12 and 18 months, in order to posterior genotypic analyses by Randomly Amplified Polymorphic DNA (RAPD) using two different primers for each strain. The results showed that all yeast preservation methods tested were able to maintain the viability of the samples during the period of the study, except the strain Candida dubliniensis stocked in mineral oil, which not survived after 12 months in these conditions. It was not observed phenotypic alterations in the results of morphological and biochemistry tests after laboratorial preservation with all used methods. However, some non stable variations were observed in phospholipase and proteinase production and in the hypertonic growth for some samples. Such variations were not related to one specific maintenance method and the altered result could be reversible in subsequent tests. Changes in the RAPD pattern were not detected in, at least, two independent reactions for both tested primers. The results showed that the maintenance methods applied in this study were able to preserve the stability of the phenotypic and genotypic characteristics, in all yeast samples stocked during the analyzed period of time. Therefore, the technical and research applicability of the samples are not unfeasible when they are preserved with those methods. Strains designated to use for specific purposes must be tested individually, in order to select the best preservation methodDoutoradoMicrobiologia e ImunologiaDoutor em Biologia Buco-Dental[s.n.]Höfling, José Francisco, 1947-Azevedo, Ricardo AntunesCandido, Regina CeliaKleiner, Aline Aparecida PizziraniJorge Junior, JacksUniversidade Estadual de Campinas (UNICAMP). Faculdade de Odontologia de Piracicaba (FOP)Programa de Pós-Graduação em Biologia Buco-DentalUNIVERSIDADE ESTADUAL DE CAMPINASSant'Ana, Priscilla de Laet, 1974-20062006-02-17T00:00:00Zinfo:eu-repo/semantics/publishedVersioninfo:eu-repo/semantics/doctoralThesisapplication/pdf137p. : il.(Broch.)https://hdl.handle.net/20.500.12733/1602047SANT'ANA, Priscilla de Laet. Diferentes processos de armazenamento de levedura: estudos sobre a variabilidade fenotipica e genotipica. 2006. 137p. Tese (doutorado) - Universidade Estadual de Campinas, Faculdade de Odontologia de Piracicaba, Piracicaba, SP. 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