Condrogênese de células tronco de líquido amniótico humano com IGF-1 cultivadas em micromass e em matriz tridimensional de quitosana e xantana

Detalhes bibliográficos
Autor(a) principal: Zuliani, Carolina Coli, 1979-
Data de Publicação: 2017
Tipo de documento: Dissertação
Idioma: por
Título da fonte: Biblioteca Digital de Teses e Dissertações da Universidade Estadual de Campinas (UNICAMP)
Texto Completo: https://hdl.handle.net/20.500.12733/1634777
Resumo: Orientador: Ibsen Bellini Coimbra
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spelling Condrogênese de células tronco de líquido amniótico humano com IGF-1 cultivadas em micromass e em matriz tridimensional de quitosana e xantanaIGF-1 induced chondrogenesis from human amniotic fluid stem cells in micromass cultures and on chitosan/xantan scaffoldsCondrogêneseCélulas-troncoLíquido amnióticoChondrogenesisStem cellsAmniotic fluidOrientador: Ibsen Bellini CoimbraTese (doutorado) - Universidade Estadual de Campinas, Faculdade de Ciências MédicasResumo: Nos últimos anos as células-tronco tornaram-se um instrumento promissor para a sua utilização na terapia celular devido a sua alta plasticidade e propriedade de originar outras células. O processo de diferenciação destas células em condrócitos tem sido realzada com o objetivo de desenvolver um tratamento efetivo para diversas patologias que comprometem a cartilagem, tecido com baixíssimo grau de regeneração espontânea, como aquelas secundárias a traumas durante atividades esportivas e enfermidades como a osteoartrite (OA). Estudos mostram que células tronco (CT) provenientes do líquido amniótico humano (LAH) apresentam o potencial de se diferenciar em células das três camadas germinativa além de possuir populações de células consideradas pluripotentes com marcadores típicos de CT embrionárias, além de se constituirem numa fonte de CT de fácil acesso e sem problemas éticos. Hoje existem comercialmente disponíveis matrizes compostas principalmente por uma mistura de colágenos, geralmente tipo I e III para implantes condrais. Todavia estes biomaterias são importados e de acesso bastante restrito no nosso meio. Assim, buscou-se por meio desse estudo avaliar a viabilidade, de um biocurativo composto por condrócitos recém-diferenciados inoculados em uma matriz tridimensional composta de quitosana e xantana produzido inteiramente com tecnologia nacional e que futuramente pudesse vir a ser utilizada no manejo clínico das lesões condrais. Isso posto, o objetivo principal deste estudo foi observar a condrogênese a partir de CTs de amostras de LAH, fornecido pelo serviço de medicina fetal do CAISM colhidos de mulheres grávidas que por indicação médica formal, segundo protocolo, que foram submetidas à amniocentese, por estímulo do fator de crescimento IGF-1, aliado a modelos de cultura em matriz tridimensional (suporte de xantana e quitosana). Metodologia: Foram colhidas amostras de 43 mulheres grávidas no segundo trimestre de gestação submetidas à amniocentese. Dessas amostras, 13 foram descartadas por apresentarem alterações no cariótipo e outras oito por problemas técnicos apresentados durante os experimentos. A condrogênese foi avaliada nas demais 22 amostras, desde a caracterização das células tronco de LAH por observação microscópica, citometria de fluxo e capacidade de diferenciação na três principais linhagens mesenquimais. Após as etapas de diferenciação em micromass e no suporte, o material foi avaliado por diferentes técnicas histológicas específicas para tecido cartilaginoso (Tricrômio de Masson (TM), Picrossirius Red (PR), Azul de Alcian (AA) e hematoxilina e eosina(HE)), a produção do colágeno II por meio de imuno-histoquímica para Colageno II e Agrecano e western blotting bem como pela expressão dos genes do colágeno tipo II, agrecano e SOX-9, específicos da cartilagem articular. Microscopia eletrônica de varredura (MEV) do conjunto células e suporte produzido. Resultados: O IGF-1 foi capaz de diferenciar as células tronco isoladas do Líquido Amniótico Humano em condrócitos articulares, tanto em culturas de alta densidade quanto naquelas que foram diretamente inoculadas no suporte de QX. A produção de matriz cartilaginosa foi observada tanto pelas análises histológicas, quanto por métodos imunohistoquímicos com marcação positiva para colágeno do tipo II e agrecano, e confirmadas pela detecção da mesma proteína produzida por meio de western blotting. O suporte testado (QX) nesse estudo apresentou bom potencial para uso em estudos futuros de desenvolvimento de um "curativo celular" já que as células apresentaram boa adesão ao material, crescimento e produção de matriz cartilaginosa como observado na MEVAbstract: It is well known that articular chondral and osteochondral lesions present a very low capability to regenerate their selves. The current management is therefore, symptomatic or invasive progressing very often to arthroplasties. Hence, the use of human amniotic fluid stem cells (HAF-SC), for reconstruction of articular cartilage due to their pluripotency and plasticity of those cells leads to a promising therapeutic alternative. Our laboratory has already observed this chondrogenic potential from HAF-SC on TGF-?3 stimuli (data under peer review) .Therefore, the aim of this study was to investigate the chondrogenic potential of HAF-SC in Micromass system (high-density cell culture) under IGF-1 stimuli for 21 days, as well as to look at their potential to differentiate directly into a new scaffold under the same conditions. The amniotic fluid have been provided by the fetal medicine unit of this university hospital, from pregnant women who have formal indication to undergo to an amniocentesis. The micromass was performed using HAF-SC first cultured in monolayer up to three passages and, after characterization by flow cytometry, they were seeded into the scaffolds of chitosan/xanthan/pluronic and cultured the constructs under the IGF-1 stimuli. The differentiation to chondrocytes was checked by histology staining¿s, hematoxylin eosin (HE), Masson's Trichrome (MT) and Picrossirius red (PR) for collagen production and Alcian blue (AB) for proteoglycans. It was also verified the collagen type II level by western blotting. The analysis of chondrogenesis into the scaffolds was performed by histology, immune-histochemistry and also by scan electron microscopy (SEM). This study was submitted to local ethics committee. We were able to confirm the chondrogenic potential of HAF-SC either in micromass system as well as, for the first time, directly into the scaffolds. The production of type II collagen was observed by immune-histochemistry and also visualized by the SEM. The conclusion of this study was that it is possible to induce chondrogenesis from HAF-SC either using micromass system or directly into the new scaffold locally produced. These results also support new studies with the constructs in animal models of osteoarthritisMestradoClínica MédicaMestra em Ciências[s.n.]Coimbra, Ibsen Bellini, 1959-Appenzeller, SimoneRezende, Marcia Uchoa deUniversidade Estadual de Campinas (UNICAMP). Faculdade de Ciências MédicasPrograma de Pós-Graduação em Clínica MédicaUNIVERSIDADE ESTADUAL DE CAMPINASZuliani, Carolina Coli, 1979-20172017-09-01T00:00:00Zinfo:eu-repo/semantics/publishedVersioninfo:eu-repo/semantics/masterThesisapplication/pdf1 recurso online ( p.) : il., digital, arquivo PDF.https://hdl.handle.net/20.500.12733/1634777ZULIANI, Carolina Coli. Condrogênese de células tronco de líquido amniótico humano com IGF-1 cultivadas em micromass e em matriz tridimensional de quitosana e xantana. 2017. 1 recurso online ( p.) Tese (doutorado) - Universidade Estadual de Campinas, Faculdade de Ciências Médicas, Campinas, SP. Disponível em: https://hdl.handle.net/20.500.12733/1634777. Acesso em: 3 set. 2024.https://repositorio.unicamp.br/acervo/detalhe/1061710Requisitos do sistema: Software para leitura de arquivo em PDFporreponame:Biblioteca Digital de Teses e Dissertações da Universidade Estadual de Campinas (UNICAMP)instname:Universidade Estadual de Campinas (UNICAMP)instacron:UNICAMPinfo:eu-repo/semantics/openAccess2018-11-28T16:51:25Zoai::1061710Biblioteca Digital de Teses e DissertaçõesPUBhttp://repositorio.unicamp.br/oai/tese/oai.aspsbubd@unicamp.bropendoar:2018-11-28T16:51:25Biblioteca Digital de Teses e Dissertações da Universidade Estadual de Campinas (UNICAMP) - Universidade Estadual de Campinas (UNICAMP)false
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