Padronização de tecnicas moleculares para o estudo da resistencia a drogas antiretrovirais em crianças infectadas pelo virus da imunodeficiencia humana tipo 1 (HIV-1) via perinatal

Detalhes bibliográficos
Autor(a) principal: Bismara, Beatriz Aparecida Passos
Data de Publicação: 2006
Tipo de documento: Dissertação
Idioma: por
Título da fonte: Biblioteca Digital de Teses e Dissertações da Universidade Estadual de Campinas (UNICAMP)
Texto Completo: https://hdl.handle.net/20.500.12733/1603286
Resumo: Orientador: Sandra Cecilia Botelho Costa
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spelling Padronização de tecnicas moleculares para o estudo da resistencia a drogas antiretrovirais em crianças infectadas pelo virus da imunodeficiencia humana tipo 1 (HIV-1) via perinatalAntiretroviral drug resistance in infected Brazilian children by human immunodeficiency virus type 1Reação em cadeia da polimeraseHIV-1 (Vírus)Terapia antirretroviral de alta atividadeResistencia viral a drogasAntiretroviral therapy, highly activeDrug resistance, viralResistancePCRHAARTOrientador: Sandra Cecilia Botelho CostaDissertação (mestrado) - Universidade Estadual de Campinas, Faculdade de Ciencias MedicasResumo: Investigamos a presença de mutações em crianças infectadas verticalmente pelo vírus da Imunodeficiência Humana tipo 1 (HIV-1) que conferem resistência aos agentes antiretrovirais. Amostras de sangue periférico foram coletadas de sessenta e seis pacientes em seguimento no do Ambulatório de Pediatria do Hospital das Clínicas da Universidade Estadual de Campinas. A partir de leucócitos destas amostras foi extraído o DNA, após diversas lavagens e precipitações. Foi preparado um Mix para 20 reações contendo 100µl de Buffer (50 mM de cloreto de potássio; 20 mM de Tris-HCl - pH 8,4); 100 µl de cloreto de magnésio (25mM); 12µl da mistura desoxirribonucléica - dNTPs (dATP, dGTP, dCTP; dTTP) a 25mM, 10µl de cada ¿primer¿ (25pmoles/µl); 0,5µl de Taq DNA polimerase e 0,5 µl do DNA a ser estudado, para a realização da PCR. As condições da reação foram: Desnaturação: 95ºC - 3 minutos; Anelamento: 55ºC ¿ 1 minuto; Extensão: 72ºC - 1 minuto (3 ciclos). Desnaturação: 95ºC ¿ 1 minuto; Anelamento: 55ºC ¿ 45 segundos; Extensão: 72ºC ¿ 1 minuto e Extensão final: 72ºC por 10 minutos (35 ciclos). As bandas foram visulizadas em gel de agarose 1%, obtendo-se uma banda de 1008 pares de bases. Os produtos selecionados foram submetidos a seguinte reação de seqüenciamento: 1,0 µl do produto da PCR; 4,0 µl de Premix (Amersham); 1,0 µl de primer 5 µM; Completar com dH2O para 10,0 µl de reação. Após a amplificação, os fragmentos foram analisados pelo Software MegaBACE¿ Sequence Analyzer, em seguida alinhados e comparados com o banco de dados público (GenBank), com o vírus selvagem, e com o programa Phred, Phrap, Consed. As principais mutações encontradas no gene da Transcriptase reversa foram: M184V(42,6%), M41L (39,3%), D67N (27,9%), T215Y (26,2%) e K70R (18%). No gene da Protease as principais encontradas foram: L63P (42,6%), L90M e M36I (32,8%), V77I (29,5%), I93L (24,6%), V82A (16,4%), I54V (14,8%) e K20R (13,1%). Concluímos que este método é muito eficaz para análise das seqüências, auxiliando na observação das mutações. Este exame deveria ser implantado na rotina para os pacientes portadores deste vírus, pois auxiliaria os clínicos na escolha de uma terapia ideal para cada paciente. As crianças que apresentavam estas mutações associadas às drogas antiretrovirais estavam com o quadro clínico afetado e a maioria dos esquemas terapêuticos não reduziam a carga viral em níveis desejáveisAbstract: In this work our purpose was to determine the subtype, prevalence of drug-resistance mutations, and assess genotypic profiles in HIV-1 infected children under antiretroviral treatment, from Campinas, São Paulo, Brazil. Blood samples from sixty six vertically human immunodeficiency virus type 1 (HIV-1) infected Brazilian children were studied for antiretroviral drug resistance. Combination therapy with protease (PR) and reverse transcriptase (RT) inhibitors can efficiently supress human immunodeficiency virus (HIV) replication, but the emergence of drug resistance variants correlates strongly with therapeutic failure1. DNA was extracted from peripheral blood mononuclear cells (PBMc) samples, and a 1.0 kb fragment containing HIV-1PR and RT-coding sequence were amplified by Nested Polymerase Chain Reaction, sequencing and subtyping. The HIV-1 subtyping based on the polymerase (pol) gene sequences (protease and reverse transcriptase-RT regions) was as follow: subtype B (83,6%), subtype F (9,8%) and B/F viral recombinant forms (6,6%). We found fifty five sequences presented significant mutations and thirty five presented common polymorphism conferring resistance to protease inhibitors (PIs). Forty one presented mutations associated with resistant to nucleoside reverse transcriptase inhibitors (NRTIs). The entire viral protease and codons 1 to 219 of the reverse transcriptase gene from 61 HIV-1 isolates were amplified and sequenced for genotyping. Two major protease inhibitor-resistance associated mutations, M36I and L90M, were most prevalent in our samples (32,8%) and the polymorphism L69P (42,6%). Minor mutation were also found at the protease gene: V77I (29,5%), V82A (16,4%), I93L (24,6%), I54V (14,8%), K20R (13,1%). Many mutations associated with reduced susceptibility to nucleoside or non-nucleoside reverse transcriptase inhibitors were detected: M41L (39,3%), M184V (42,6%), D67N (27,9%), T215Y (26,2%), L210W (21%), K70R (18%) and E44D (11,5%). This study demonstrated that 98,3% of the studied population from the Campinas, showing evidences of therapy failure, presented viral genomic mutations associated with drug resistance. The main antiretroviral to which this population showed resistance were PI nelfinavir (54%), and ritonavir with lopinavir (18%), and the NNRTIs efavirenz (18%) and nevirapine (3,2%), and the NRTIs zidovudine (60,6%), didanosine (47,5%), lamivudine (45,9%). Ninety-eight percent of patients under antiretroviral therapy and with high viral load counts showed resistance to at least one of the antiretroviral analyzed.MestradoMestre em Farmacologia[s.n.]Costa, Sandra Cecília Botelho, 1951-Aoki, Francisco HideoMolina, Rosana MaraUniversidade Estadual de Campinas (UNICAMP). Faculdade de Ciências MédicasPrograma de Pós-Graduação em FarmacologiaUNIVERSIDADE ESTADUAL DE CAMPINASBismara, Beatriz Aparecida Passos20062006-08-30T00:00:00Zinfo:eu-repo/semantics/publishedVersioninfo:eu-repo/semantics/masterThesisapplication/pdf(Broch.)https://hdl.handle.net/20.500.12733/1603286BISMARA, Beatriz Aparecida Passos. Padronização de tecnicas moleculares para o estudo da resistencia a drogas antiretrovirais em crianças infectadas pelo virus da imunodeficiencia humana tipo 1 (HIV-1) via perinatal. 2006. Dissertação (mestrado) - Universidade Estadual de Campinas, Faculdade de Ciencias Medicas, Campinas, SP. Disponível em: https://hdl.handle.net/20.500.12733/1603286. Acesso em: 2 set. 2024.https://repositorio.unicamp.br/acervo/detalhe/375145porreponame:Biblioteca Digital de Teses e Dissertações da Universidade Estadual de Campinas (UNICAMP)instname:Universidade Estadual de Campinas (UNICAMP)instacron:UNICAMPinfo:eu-repo/semantics/openAccess2017-02-18T04:37:47Zoai::375145Biblioteca Digital de Teses e DissertaçõesPUBhttp://repositorio.unicamp.br/oai/tese/oai.aspsbubd@unicamp.bropendoar:2017-02-18T04:37:47Biblioteca Digital de Teses e Dissertações da Universidade Estadual de Campinas (UNICAMP) - Universidade Estadual de Campinas (UNICAMP)false
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