O sequenciamento de alto desempenho no diagnóstico das displasias esqueléticas : The next-generation sequencing in the diagnosis of skeletal dysplasias

Detalhes bibliográficos
Autor(a) principal: Silveira, Karina da Costa, 1989-
Data de Publicação: 2018
Tipo de documento: Tese
Idioma: por
Título da fonte: Biblioteca Digital de Teses e Dissertações da Universidade Estadual de Campinas (UNICAMP)
Texto Completo: https://hdl.handle.net/20.500.12733/1633687
Resumo: Orientador: Denise Pontes Cavalcanti
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Embora as técnicas personalizadas de NGS (sequenciamento de alto desempenho) sejam atualmente os métodos preferenciais para analisar essas condições na prática médica, os resultados publicados até o momento não mostram um alto rendimento com emprego das mesmas. Tampouco uma especulação sobre os custos adicionais relacionados ao sequenciamento por Sanger (SS), necessário seja para confirmação das variantes patogênicas encontradas, seja para cobrir regiões pouco cobertas pelo NGS, foi realizada até o momento. Desse modo, o objetivo do presente trabalho foi avaliar a utilização de NGS com um painel personalizado de genes no estudo das OCD utilizando uma coorte de pacientes avaliados pelo grupo local de Displasias Esqueléticas. A coorte investigada incluiu 88 pacientes com OCD previamente diagnosticados por critérios clínico-radiológicos, os quais foram analisados por diferentes painéis de NGS. O sequenciamento foi realizado utilizando-se três painéis NGS personalizados (TSCA - TruSeq Custom Amplicon e Nextera da Illumina e IT-Amp - Ion AmpliSeq da Life Technologies ¿ Ion Torrent) com genes previamente selecionados a partir da seleção dos pacientes ou por critério como frequência das OCD, no caso do IT-Amp. Todas as variantes patogênicas encontradas pelas técnicas TSCA e IT-Amp foram confirmadas pelo SS. Da mesma forma, o SS foi utilizado para completar a investigação de regiões insuficientemente cobertas pelo NGS. Setenta e quatro mutações diferentes, das quais 52 variantes inéditas, foram encontradas em 61 (69,3%) pacientes. No entanto, as mutações encontradas em dois pacientes (nos genes PCYT1A e LIFR respectivamente) foram detectadas apenas por SS ao investigar regiões de baixa cobertura com o NGS. Não foi possível encontrar variante(s) patogênica(s) em 27 (30,7%) pacientes. No entanto, em pelo menos 11 pacientes a heterogeneidade genética de condições ainda não completamente elucidadas provavelmente foi a causa da negatividade. Considerando apenas os insumos, a estimativa de custo adicional para a concluir a investigação de 36 pacientes avaliados pelo TSCA foi de 83%. Em conclusão, a alta taxa de positividade deste estudo certamente está relacionada seja ao diagnóstico radiológico prévio dos pacientes, bem como pela utilização do SS para as regiões de cobertura insuficiente. A quantidade de regiões gênicas com baixa cobertura sugere que as técnicas de NGS personalizadas ainda carecem de aprimoramento. Finalmente, estimamos um aumento de 83% para o valor inicial de NGS, e mesmo com o aditivo, alguns casos ainda permaneceram sem diagnósticoAbstract: The molecular investigation of the skeletal dysplasias, also known as osteochondrodysplasias (OCD), is critical for both the accuracy of diagnosis and genetic counseling. Although NGS (next-generation sequencing) techniques are currently the preferred methods for analyzing these conditions in clinical practice, the published results have not reported high diagnostic yield to date, nor a speculation regarding additional costs due to the Sanger sequencing (SS), required to the confirmation of the found pathogenic variants as well as to analyse regions insufficient covered, has been performed. Thus, the goals of the present study were to evaluate the use of NGS with a customized panel of genes in the OCD study using a cohort of patients evaluated by the local group of Skeletal Dysplasias. The cohort investigated included 88 patients with OCD previously diagnosed by clinical-radiological criteria, which were analyzed by different NGS panels. The sequencing was performed using three custom NGS (TSCA - TruSeq Custom Amplicon and Nextera by Illumina, and IT-Amp - Ion AmpliSeq by Life Technologies) with selected genes according to the patient's diagnosis or by frequency criterion in the case of IT-Amp. All the pathogenic variants found by both, the TSCA and IT-Amp techniques, were confirmed by SS. Likewise, the SS was used to complete the investigation of regions insufficiently covered by NGS. Seventy-four different mutations, of which 52 novel variants, were found in 61 (69.3%) patients. However, mutations found in two patients (in the PCYT1A and LIFR genes respectively), were only detected when the regions of low coverage were under investigation by SS. The pathogenic variant(s) could not be found in 27 (30.7%) patients. However, in at least 11 patients, the negative results can be explained by the genetic heterogeneity of the respective conditions. Considering only the main reagents, the estimated additional costs to complete the investigation of 36 patients evaluated by TSCA was 83%. In conclusion, the high positivity rate of this study is certainly related to the previous radiological diagnosis of the patients, as well as the use of SS for regions with insufficient coverage. The number of gene regions with low coverage suggests that the custom NGS techniques still need improvement. Finally, we estimate an increase of 83% for the initial value of NGS, and even with the additive, some cases remained without the diagnosisDoutoradoGenética MédicaDoutora em CiênciasCAPES01-P-3368/2017[s.n.]Cavalcanti, Denise Pontes, 1957-Pogue, Robert EdwardJorge, Alexander Augusto de LimaTorres, Fábio RossiSartorato, Edi LúciaUniversidade Estadual de Campinas (UNICAMP). Faculdade de Ciências MédicasPrograma de Pós-Graduação em Ciências MédicasUNIVERSIDADE ESTADUAL DE CAMPINASSilveira, Karina da Costa, 1989-20182018-02-23T00:00:00Zinfo:eu-repo/semantics/publishedVersioninfo:eu-repo/semantics/doctoralThesisapplication/pdf1 recurso online ( 158 p.) : il., digital, arquivo PDF.https://hdl.handle.net/20.500.12733/1633687SILVEIRA, Karina da Costa. O sequenciamento de alto desempenho no diagnóstico das displasias esqueléticas : The next-generation sequencing in the diagnosis of skeletal dysplasias . 2018. 1 recurso online ( 158 p.) Tese (doutorado) - Universidade Estadual de Campinas, Faculdade de Ciências Médicas, Campinas, SP. Disponível em: https://hdl.handle.net/20.500.12733/1633687. 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