Estudos sobre atividade de calpastatina em carne bovina e obtenção de anticorpo policlonal anti GST-calpastatina

Detalhes bibliográficos
Autor(a) principal: Rubensam, Jane Maria
Data de Publicação: 1999
Tipo de documento: Tese
Idioma: por
Título da fonte: Biblioteca Digital de Teses e Dissertações da Universidade Estadual de Campinas (UNICAMP)
Texto Completo: https://hdl.handle.net/20.500.12733/1587853
Resumo: Orientadores: Pedro Eduardo de Felicio, Carlos Termignoni
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spelling Estudos sobre atividade de calpastatina em carne bovina e obtenção de anticorpo policlonal anti GST-calpastatinaCarne bovinaBovino - RaçasOrientadores: Pedro Eduardo de Felicio, Carlos TermignoniTese (doutorado) - Universidade Estadual de Campinas, Faculdade de Engenharia de AlimentosResumo: Este trabalho teve como objetivo estudar a relação da atividade de calpastatina e a força de cisalhamento da carne bovina bem como produzir anticorpo policlonal anti-calpastatina para futuro uso em estudos do potencial da calpastatina como indicador da maciez tendo em vista que esta característica é considerada como a mais importante para a qualidade sensorial da carne bovina. Foram realizados dois experimentos. No primeiro, estudou-se a influência do genótipo B0S indicus na atividade de calpastatina e na textura do músculo longissimus dorsi de novilhos criados no Sul do Brasil e a variabilidade destas características. A atividade de calpastatina foi determinada pelo ensaio de inibição da m-calpaína e a textura através da força de cisalhamento (Warner Bratzler Shear). Amostras de contrafilé (músculo L. dorsi) provenientes de 26 bovinos, sendo 14 Polled Hereford (HH), sete ¾ Hereford 1/4Nelore (3/4H1/4N) e cinco S/8Hereford 3/8Nelore (S/8H3/8N), machos castrados, abatidos aos dois anos de. idade, foram coletadas 24 h após o abate e analisadas quanto à atividade de calpastatina e textura, tanto no 1 ° dia post moriem quanto após um período de maturação de 10 dias a 2° C. A carne de novilhos S/8H3/8N apresentou, no 1° dia, maior (p<O,OS) atividade de calpastatina e força de cisalhamento do que a carne de novilhos HH e 3/4H1/4N. Não foram detectadas diferenças (p>0,05) entre os grupos HH e 3/4H1/4N para as mesmas características. Após 10 dias, houve uma diferença na atividade de calpastatina, porém não significativa (p>O,OS), entre o grupo 5/8H3/8N (1,S7U/g) e os demais (HH=1,23U/g; 3/4H1/4N=1,35U/g), e diferença significativa entre os grupos HH e S/8H3/8N para força de cisalhamento (3,67 e 5,00kg, respectivamente).Neste experimento, concluiu-se que a atividade de calpastatina determinada 24 horas post moriem, pode ser útil para a previsão da textura da carne, maturada ou não. Além disso, a participação do genótipo B.os indicus nos rebanhos bovinos da Região Sul poderá resultar em carne de pior textura. No segundo experimento, o gene contendo os domínios 2, 3, 4 e a região não traduzida 3' da calpastatina muscular bovina, inserido no vetor pGEX-5X-2, denominado pBSA1 (Killefer & Koohmaraie, 1994), gentilmente cedido pelo Dr. Mohammad Koohmaraie, pesquisador líder do Meat Animal Research Center, Clay Center, Nebraska, EUA, foi utilizado para expressão da calpastatina na forma de GST-calpastatina, em células de Escherichia coli AD202 DH5a. Após purificação em coluna de Glutathione-Sepharose 4B, inoculou-se 100 µg de GSTcalpastatina em coelho, via subcutânea, por 4 vezes, com intervalos de 21 dias. O anticorpo policlonal anti GST -calpastatina, purificado em Proteína G HiTrap, reconheceu calpastatina de extrato muscular bovino aquecido, com 67 kDa, através do método Western Blot. Através do teste ELlSA (Enzyme Linked Immunosorbent Assay) de. competição, o anticorpo policlonal anti GSTcalpastatina, em concentrações de 60 a 230 µg IgG/poço, reconheceu 70 mU da calpastatina muscular presente no extrato aquecido numa concentração dez vezes maior. GST -calpastatina também foi expressada em E. coli XL 1 Blue e, após purificação em cromatografia de afinidade, foi inoculada em coelho para obtenção de anticorpo policlonal. Este anticorpo foi utilizado em teste ELISA de captura de anticorpos para identificação da calpastatina muscular bovina em extrato muscular aquecido. A concentração de anticorpo policlonal anti GST -calpastatina, igual a 45 µg/ml, apresentou resposta proporcional à quantidade de calpastatina no extrato muscular. A produção e purificação de anticorpo policlonal anti GST -calpastatina constituirá um importante passo rumo ao desenvolvimento de testes, para determinação direta da atividade de calpastatina em amostras de músculos bovinos coletados por biópsiaAbstract: The objective of this work was to study the relationship between the longissimus dorsi muscle calpastatin activity and the shear force trom steers of different genotypes as well to produce polyclonal anti-calpastatin antibodies to be used as meat tenderness predictor in further research. Tenderness is considered the most important sensory quality attribute of beef. Two experiments were conducted. In the first, it was studied the Bos indicus genotype influence on calpastatin activity and texture of boneless rib steaks (longissimus dorsi muscle) at 24 hours after slaughter and at the 10th day of aging at 2°C from steers raised in thé South of Brazil. Calpastatin activity was determined by m-calpain inhibition assay anel texture by shear force (Warner-Bratzler). Beef rib samples from 26 steers, being 14 Polled Hereford (HH), seven 3/4 Hereford 1/4 Nelore (3/4H1/4N) and five 5/8 Hereford 3/8 Nelore (5/8H3/8N) were analysed. Rib samples from 5/8H3/8N steers showed higher (p<0.05) calpastatin activity and shear force values than beef trom HH and 3/4H1/4N steers in the 1st day. No differences (p>0.05) were detected in the same traits between groups HH and 3/4H1I4N. After 10 days of aging, there was a difference in calpastatin activity, although non-significant (p>0.05), amongst group 5/8H3/8N (1.57U/g) and others (HH=1.23U/g; 3/4H1/4N=1.35U/g), and a significant difference in shear force between groups HH and 5/8H3/8N (3.67 and 5.00kg, respectively). It was concluded that the calpastatin activity determined 24 hs post mortem can be useful to predict the texture of beef, aged or not. Also, the increasing participation of Bos indicus genotype in the South Region cattle herds, besides the productivity advantages, may result in beef of lower texture quality. In the second experiment, polyclonal antibodies were raised in rabbits from a cloned pBSA1 (vector pGEX-5X-2, Pharmacia) encoding domains 2, 3, 4 and the 3' untranslated region of bovine calpastatin gene, kindly provided by Or. Mohammad Koohmaraie, leader researcher trom Meat Animal Research Center Roman L. Hurska, Clay Center, Nebraska, USA.. The cloned pBSA1 (KILLEFER & KOOHMARAIE, 1994) was used to expression of a GST-calpastatin form in Escherichia coli AD202 and DH5a cells. After purification in Glutathione Sepharose 4B column, aliquot of 100 µg GST-calpastatin was inoculated in rabbit, four times with 21 day intervals. The polyclonal antibodies purified in Protein G HiTrap recognized a 67 kDa protein from prerigor bovine heated muscle homogenates by Western blot method. By ELlSA competition assay, polyclonal anti-GST-calpastatin antibodies within the range of 60 to 230µg IgG/well detected until 70 mU of calpastatin trom bovine prerigor longissimus dorsi muscle homogenate in which original activity was ten times higher. GST -calpastatin was also expressed in E. coli XL 1 Blue that after an affinity purification was used to raise polyclonal antibodies in rabbits. The polyclonal antibodies anti-GST-calpastatin were used to perform an antibodies capture ELlSA test to identify calpastatin from a heated muscle homogenate. A 45 J..lg/ml of antiGST -calpastatin polyclonal antibodies concentration presented a proportional response in relation to the muscle heated homogenate calpastatin concentration. The polyclonal anti-GST -cal pastati n antibodies obtained in this work could be used to develop field tests useful to determine calpastatin activity in bovine muscles collected by biopsyDoutoradoDoutor em Tecnologia de Alimentos[s.n.]Felicio, Pedro Eduardo de, 1950-Termignoni, CarlosSato, Helia HarumiSilva, Edir Nepomuceno daCarvalho, Carla Roberta de OliveiraLuchiari Filho, AlbinoPereira, Jose LuizLeme, Paulo RobertoUniversidade Estadual de Campinas (UNICAMP). Faculdade de Engenharia de AlimentosPrograma de Pós-Graduação em Tecnologia de AlimentosUNIVERSIDADE ESTADUAL DE CAMPINASRubensam, Jane Maria19991999-05-04T00:00:00Zinfo:eu-repo/semantics/publishedVersioninfo:eu-repo/semantics/doctoralThesisapplication/pdf79f. : il.https://hdl.handle.net/20.500.12733/1587853RUBENSAM, Jane Maria. Estudos sobre atividade de calpastatina em carne bovina e obtenção de anticorpo policlonal anti GST-calpastatina. 1999. 79f. Tese (doutorado) - Universidade Estadual de Campinas, Faculdade de Engenharia de Alimentos, Campinas, SP. Disponível em: https://hdl.handle.net/20.500.12733/1587853. Acesso em: 2 set. 2024.https://repositorio.unicamp.br/acervo/detalhe/176178porreponame:Biblioteca Digital de Teses e Dissertações da Universidade Estadual de Campinas (UNICAMP)instname:Universidade Estadual de Campinas (UNICAMP)instacron:UNICAMPinfo:eu-repo/semantics/openAccess2017-02-18T02:59:15Zoai::176178Biblioteca Digital de Teses e DissertaçõesPUBhttp://repositorio.unicamp.br/oai/tese/oai.aspsbubd@unicamp.bropendoar:2017-02-18T02:59:15Biblioteca Digital de Teses e Dissertações da Universidade Estadual de Campinas (UNICAMP) - Universidade Estadual de Campinas (UNICAMP)false
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