Avaliação dos fármacos VX-809 E VX-770 na função da CFTR e a função de canais alternativos de cloreto em células primárias epiteliais das vias aéreas de pacientes com fibrose cística

Detalhes bibliográficos
Autor(a) principal: Kmit, Arthur, 1987-
Data de Publicação: 2018
Tipo de documento: Tese
Idioma: por
Título da fonte: Biblioteca Digital de Teses e Dissertações da Universidade Estadual de Campinas (UNICAMP)
Texto Completo: https://hdl.handle.net/20.500.12733/1633840
Resumo: Orientadores: Margarida Sofia Pereira Duarte Amaral, Carmen Sílvia Bertuzzo
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spelling Avaliação dos fármacos VX-809 E VX-770 na função da CFTR e a função de canais alternativos de cloreto em células primárias epiteliais das vias aéreas de pacientes com fibrose císticaEvaluation of VX-809 and VX-770 drugs in the function of CFTR and the function of alternative chloride channels in primary epithelial cells of airways from cystic fibrosis patientsRegulador de condutância transmembrana em fibrose císticaFibrose císticaTécnicas de cultura de célulasEletrofisiologiaTecidos - Efeitos de drogasCystic fibrosis transmembrane conductance regulatorCystic fibrosisCell culture techniquesElectrophysiologyTissues, Drug effectsOrientadores: Margarida Sofia Pereira Duarte Amaral, Carmen Sílvia BertuzzoTese (doutorado) - Universidade Estadual de Campinas, Faculdade de Ciências MédicasResumo: A fibrose cística (FC) é uma doença autossômica recessiva que afeta mais de 85 mil pessoas em todo o mundo e pouco menos de 4 mil no Brasil, que é o 7º país com mais pacientes registrados. Pacientes fibrocísticos sofrem com a complexidade e gravidade da doença, com uma sobrevida média de 12 anos no Brasil e 30 anos em países desenvolvidos. A FC é consequência de mutações no gene CFTR (Cystic Fibrosis Transmembrane conductance Regulator), que codifica uma proteína transmembranar de mesmo nome, expressa na membrana apical de células epiteliais. Atuando como um canal de cloreto e bicarbonato, a proteína CFTR é essencial para manutenção e equilíbrio hidrosalino do líquido superficial nos tecidos epiteliais. O déficit de sua função ou sua ausência provoca a desidratação e acidificação deste líquido que gera diversas complicações nos órgãos relacionados, principalmente no pulmão causando acumulo de muco e criando um ambiente favorável para adesão e proliferação de patógenos, que leva a perda de função pulmonar e uma morte prematura do paciente com FC. Atualmente, foram desenvolvidos fármacos moduladores da CFTR, que corrigem a função deficiente na FC e promovem melhoras no fenótipo dos pacientes fibrocísticos. Fármacos candidatos foram avaliados em estudos in vitro de células primárias de pacientes FC e apresentaram eficácia para algumas mutações do gene CFTR, que seguido de testes clínicos, possibilitaram a formulação dos medicamentos Ivacaftor® (VX-770), Lumacaftor® (VX-809), Orkambi® (VX-809 + VX-770) Tezacaftor® (VX-661) e Symdeko® (VX-661 + VX-770). Objetivo: Avaliar a função da CFTR e a ação de fármacos moduladores da CFTR (VX-809 e VX-770), e a função de canais de cloretos alternativos. Métodos: Foram isoladas e cultivas células HBE oriundas de 5 lóbulos pulmonares, e células epiteliais traqueais (HTE) foram isoladas de um fragmento traqueal. Também foram isoladas e cultivas células HNE de 23 pacientes. Após a manutenção dessas células em cultura, elas foram cultivadas em filtros de membrana poliéster em interface ar-líquido (ALI) para diferenciarem e polarizarem, formando monocamadas celulares confluentes. Os fármacos da CFTR, corretor VX-809 e potenciador VX-770, foram analisados na Câmara de Ussing pelo protocolo de quantificando a secreção de Cl- mediada pelo canal CFTR, nas células HNE e HBE dos pacientes estudados. Resultados: A técnica da análise de função da CFTR em células HBE e HNE diferenciaram estatisticamente a atividade da CFTR de pacientes não FC e FC. As análises nas células HNE também diferenciaram pacientes não FC (wt/wt) de pacientes não FC portadores (fc / wt). A avaliação da ação dos fármacos foi baseada nas funções basais da CFTR (100%) de pacientes não FC (wt /wt). A ação do VX-809, VX-770 e dos dois combinados, VX809 + VX-770, foram positivas em células HBE e HNE dos pacientes FC. Sendo assim, a função da CFTR basal e modulada pelos fármacos, varia de paciente para paciente, mesmo aqueles que apresentavam a mesma mutação. No presente trabalho, foi evidenciado que células HBE e HNE são ferramentas importantes para quantificação individual da ação dos fármacos moduladores da CFTR. Baseadas nessas premissas foram testadas as funções da CFTR em células HNE de 12 pacientes F508del / F508del em relação a dois polimorfismos em dois genes, (SNP rs7512462 no gene SLC26A9 e o SNP rs3788766 no gene SLC6A14). O SNP rs7512462 demonstrou modular positivamente a função da CFTR e a ação do VX-809 e/ou VX-770 nas células HNE. Já no outro SNP, o rs3788766, demonstrou modular positivamente a função basal da CFTR. Na investigação de alternativas na correção do defeito de transporte iônico no epitélio FC, foi analisada a função da TMEM16A nas células HBE e HNE pela sua ativação com o ATP, e foi comprovada a presença deste canal pela sua inibição com o uso do inibidor específico de TMEM16s, o CaCCinh-AO1. A função da TMEM16A é independente da função da CFTR, e também da ação dos fármacos moduladores, VX-809 e/ou VX-770, demonstrando ser um alvo potencial para regular o transporte de Cl- nas vias aéreas de pacientes com FC, a ser somado com o tratamento dos fármacos na FC. Conclusão: A cultura primária de células epiteliais brônquicas e nasais demonstraram serem ferramentas importantes para a realização de estudos de função da CFTR, ação de fármacos moduladores da CFTR, polimorfismos em genes moduladores da CFTR e/ou FC e de canais alternativos para a correção do transporte iônico no epitélio da FC. Tal estratégia parece ser relevante para aplicar a medicina personalizadaAbstract: Cystic fibrosis (CF) is an autosomal recessive disease affecting more than 85,000 people worldwide and just under 4,000 in Brazil, which is the 7th country with the most registered patients. Fibrocystic patients suffer from the complexity and severity of the disease, with an average survival of 12 years in Brazil and 30 years in developed countries. CF is a consequence of mutations in the CFTR (Cystic Fibrosis Transmembrane Conductivity Regulator) gene, which encodes a transmembrane protein of the same name, expressed on the apical membrane of epithelial cells. Acting as a chloride and bicarbonate channel, CFTR is essential for the maintenance and hydrosaline balance of surface fluid in epithelial tissues. The deficit of its function or its absence causes the dehydration and acidification of this liquid that generates several complications in the related organs, mainly in the lung causing accumulation of mucus and creating a favorable environment for adhesion and proliferation of pathogens, which leads to loss of pulmonary function and a premature death of the CF patient. Currently, CFTR modulating drugs have been developed that correct CF deficient function and promote improvements in the phenotype of fibrocystic patients. Candidates drugs were evaluated in in vitro studies of CF patients' primary cells and showed efficacy for some mutations of the CFTR gene, which followed the clinical trials, allowing the formulation of the drugs Ivacaftor® (VX-770), Lumacaftor® (VX-809) , Orkambi® (VX-809 + VX-770) Tezacaftor® (VX-661) and Symdeko® (VX-661 + VX-770). Objective: To evaluate the function of CFTR and the action of CFTR modulating drugs (VX-809 and VX-770), and the function of alternative chloride channels. Methods: Bronchial epithelial cells (HBE) from 5 lung lobes were isolated and cultured, and tracheal epithelial cells (HTE) were isolated from a tracheal fragment. Nasal epithelial cells (HNE) cells from 23 patients were also isolated and cultured. After maintenance of these cells in culture, they were grown on air-liquid interface (ALI) polyester membrane filters to differentiate and polarize, forming confluent cell monolayers. CFTR drugs, VX-809 and VX-770 were analyzed in the Ussing Chamber by the quantification protocol of Cl-mediated by the CFTR channel in the HNE and HBE cells of the patients studied. Results: The technique of CFTR function analysis in HBE and HNE cells statistically differentiated CFTR activity from non-CF and CF patients. Analyzes in HNE cells also differentiated non-CF patients (wt/wt) from non-CF patients (cf/wt). The evaluation of drug action was based on baseline CFTR functions (100%) of non-CF patients (wt/wt). The action of VX-809, VX-770 and the two combined, VX809+VX-770, were positive in HBE and HNE cells of FC patients. Thus, the function of baseline and drug-modulated CFTRs varies from patient to patient, even those with the same mutation. In the present work, it was evidenced that HBE and HNE cells are important tools for individual quantification of the action of the CFTR modulating drugs. Based on these assumptions, the functions of CFTR in HNE cells from 12 F508del/F508del patients were tested for two polymorphisms in two genes (SNP rs7512462 in the SLC26A9 gene and SNP rs3788766 in the SLC6A14 gene). SNP rs7512462 has been shown to modulate positively the function of CFTR and the action of VX-809 and/or VX-770 on HNE cells. In the other SNP, rs3788766, it was shown to modulate the basal function of CFTR. In the investigation of alternatives in the correction of the ionic transport defect in the CF epithelium, the function of TMEM16A in HBE and HNE cells was analyzed for its activation with ATP, and the presence of this channel was confirmed by its inhibition with the use of the specific inhibitor of TMEM16s, CaCCinh-AO1. The function of TMEM16A is independent of the function of CFTR and the action of modulating drugs, VX-809 and/or VX-770, proving to be a potential target for regulating the transport of Cl- in the airways of CF patients, be added to the treatment of CF drugs. Conclusion: The primary HBE and HNE cells has been shown to be important tools for the study of CFTR function, CFTR modulating drugs, polymorphisms in CFTR and/or CF modulating genes and alternative channels for the correction of ionic transport in the CF epithelium. Such a strategy seems to be relevant in applying personalized medicineDoutoradoCiências BiomédicasDoutor em Ciências MédicasCAPES01P3368/2017FAPESP2014/14666-3[s.n.]Amaral, Margarida DuarteBertuzzo, Carmen Sílvia, 1963-Menezes, Jackson de SouzaSilva Filho, Luiz Vicente Ribeiro Ferreira daCollares-Buzato, Carla BeatrizUniversidade Estadual de Campinas. Faculdade de Ciências MédicasPrograma de Pós-Graduação em Ciências MédicasUNIVERSIDADE ESTADUAL DE CAMPINASKmit, Arthur, 1987-20182018-02-20T00:00:00Zinfo:eu-repo/semantics/publishedVersioninfo:eu-repo/semantics/doctoralThesisapplication/pdf1 recurso online (135 p.) : il., digital, arquivo PDF.https://hdl.handle.net/20.500.12733/1633840KMIT, Arthur. Avaliação dos fármacos VX-809 E VX-770 na função da CFTR e a função de canais alternativos de cloreto em células primárias epiteliais das vias aéreas de pacientes com fibrose cística. 2018. 1 recurso online (135 p.) Tese (doutorado) - Universidade Estadual de Campinas, Faculdade de Ciências Médicas, Campinas, SP. Disponível em: https://hdl.handle.net/20.500.12733/1633840. Acesso em: 15 mai. 2024.https://repositorio.unicamp.br/acervo/detalhe/1014662Requisitos do sistema: Software para leitura de arquivo em PDFporreponame:Biblioteca Digital de Teses e Dissertações da Universidade Estadual de Campinas (UNICAMP)instname:Universidade Estadual de Campinas (UNICAMP)instacron:UNICAMPinfo:eu-repo/semantics/openAccess2018-06-29T10:45:37Zoai::1014662Biblioteca Digital de Teses e DissertaçõesPUBhttp://repositorio.unicamp.br/oai/tese/oai.aspsbubd@unicamp.bropendoar:2018-06-29T10:45:37Biblioteca Digital de Teses e Dissertações da Universidade Estadual de Campinas (UNICAMP) - Universidade Estadual de Campinas (UNICAMP)false
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