Caracterização das proteinas humanas Mov34 e PACT e analise da sua interação com o RNA do virus da dengue

Detalhes bibliográficos
Autor(a) principal: Alves, Beatriz Santos Capela, 1978-
Data de Publicação: 2008
Tipo de documento: Tese
Idioma: por
Título da fonte: Biblioteca Digital de Teses e Dissertações da Universidade Estadual de Campinas (UNICAMP)
Texto Completo: https://hdl.handle.net/20.500.12733/1607748
Resumo: Orientador: Nilson Ivo Tonin Zanchin
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A região 5¿UTR viral possui organização similar à dos mRNAs eucarióticos, diferentemente da região 3¿UTR que é longa e não possui cauda de poli(A). Em vez disso, na região 3¿UTR encontram-se estruturas conservadas entre os diferentes Flavivirus, dentre elas a estrutura 3¿ stem-loop (3¿SL) que é indispensável para a replicação do RNA viral. O objetivo do nosso estudo foi identificar novas proteínas humanas capazes de interagir com a estrutura 3¿SL do RNA do vírus da dengue. Dados da literatura descrevem que a proteína Mov34 de camundongo interage com 3¿SL do vírus da encefalite japonesa. Devido à alta similaridade entre as proteínas ortólogas humana e de camundongo, bem como das respectivas estruturas 3¿SL dos vírus da dengue e da encefalite japonesa, foi testada a interação entre a Mov34 humana com o 3¿SL do vírus da dengue. Porém, em nenhuma das condições testadas foi possível obter evidência de interação da Mov34 humana com 3¿SL dos vírus da dengue e da encefalite japonesa. Para a identificação de novas proteínas que são capazes de interagir com a estrutura 3¿SL do RNA do vírus da dengue foi utilizado o ensaio de triplo-híbrido de levedura. A proteína humana PACT, conhecida como proteína celular ativadora de PKR, foi isolada neste ensaio utilizando 3¿SL como isca. PKR é uma quinase ativada por PACT ou RNA dupla-fita. A ativação de PKR leva a um estado antiviral adquirido pela fosforilação do fator de iniciação da tradução eIF2a e conseqüente inibição da tradução. Além disso, PKR está envolvida em outras vias de transdução de sinal e na resposta celular à proteínas desenoveladas. A ação antiviral de PACT é evidenciada pela ação de proteínas dos vírus influenza A e herpes simplex tipo 1 que inibem a ativação de PKR por PACT e por RNA dupla-fita. A interação direta de PACT com 3¿SL do RNA do vírus da dengue foi confirmada por ensaio de UVcrosslinking PACT possui três domínios de interação com RNA dupla-fita, sendo que os dois domínios N-terminais são responsáveis pela sua interação com o 3¿SL. Foi identificada uma região específica do 3¿SL, o stem-loop superior, onde PACT interage com maior afinidade. Além disso, foi mostrado que PACT endógena de células HEK293 é capaz de interagir com o 3¿SL biotinilado. Para caracterizar a função desta interação durante a infecção viral, foi desenvolvida uma linhagem celular com inibição da expressão de PACT através da técnica de RNA de interferência. Com esta linhagem poderemos analisar a importância da interação entre PACT e o RNA do vírus da dengue quanto à ativação e/ou inibição de PKR durante a infecção viralAbstract: The combat to the dengue virus is basically limited to the efforts in eliminating the transmitter mosquito, the Aedes aegypti. But this strategy is not very efficient. The development of new instruments of combat to dengue virus requires improved knowledge about the virus biology and its relation to hosts. The dengue virus genome is a single-stranded RNA of positive polarity flanked by a 5¿ untranslated region (UTR) of ~100 bases and a highly structured 3¿ UTR of ~450 bases. As many other viruses, dengue encodes the enzymes required for its genome replication, but relies completely on the host translational machinery to synthesize its proteins. The essential difference between host cellular mRNAs and dengue virus genome RNA involves the 3¿UTR, which instead of a polyadenylate tail contains highly conserved structural elements, including the 3' stem-loop (3¿SL), located at the 3' terminus of the 3'UTR of many flaviviruses that is essential for their replication. The aim of this study is to identify new human proteins capable of interacting with dengue virus RNA 3¿SL structure. Literature data describe that the murine Mov34 protein interacts with Japanese encephalitis virus 3¿SL. Giving the high similarity between the human and murine ortholog proteins, as well as the conservation of the Flavivivirus RNA 3¿SL structure, we tested the interaction between the human Mov34 and the dengue virus 3¿SL. However, no interaction was detected under the conditions used in this work. In addition, the yeast three-hybrid system was used to screen for novel proteins that interact with the dengue virus 3¿SL. Human PACT, known as the cellular protein activator of PKR, was identified as a putative 3¿SL-interacting protein. PKR is an interferon-inducible, PACT or double-stranded RNA activated protein kinase. Activated PKR phosphorylates the translation initiation factor eIF2a, inhibiting translation of cellular and viral RNAs, leading to a cellular antiviral state. PACT and doublestranded RNA activation of PKR is inhibited by influenza A and herpes simplex type 1 virus proteins during viral infection, indicating that PACT plays a role in the cellular antiviral state. Direct interaction between PACT and 3¿SL was confirmed by UV-crosslinking assays. PACT contains three doublestranded RNA interaction motifs, but only the two N-terminal motifs are responsible for 3¿SL interaction. A 3¿SL specific region, the top stem-loop, was identified to interact with PACT with higher affinity. Furthermore, HEK293 cells endogenous PACT interacts with biotin-labeled 3¿SL. To further characterize PACT-3¿SL interaction during dengue virus infection, a cell line with low expression of PACT was developed using the RNA interference technique. This cell line will be used to determine the propagation rate of dengue virus which is expected to reveal the importance of PACT either for the cell antiviral state or for dengue virus proliferationDoutoradoGenética Animal e EvoluçãoDoutor em Genética e Biologia Molecular[s.n.]Zanchin, Nilson Ivo Tonin, 1962-Benedetti, Celso EduardoYunes, José AndrésFigueiredo, Luiz Tadeu MoraesVentura, Armando MoraisUniversidade Estadual de Campinas (UNICAMP). Instituto de BiologiaPrograma de Pós-Graduação em Genética e Biologia MolecularUNIVERSIDADE ESTADUAL DE CAMPINASAlves, Beatriz Santos Capela, 1978-20082008-08-21T00:00:00Zinfo:eu-repo/semantics/publishedVersioninfo:eu-repo/semantics/doctoralThesisapplication/pdf110p. : il.(Broch.)https://hdl.handle.net/20.500.12733/1607748ALVES, Beatriz Santos Capela. Caracterização das proteinas humanas Mov34 e PACT e analise da sua interação com o RNA do virus da dengue. 2008. 110p. Tese (doutorado) - Universidade Estadual de Campinas, Instituto de Biologia, Campinas, SP. Disponível em: https://hdl.handle.net/20.500.12733/1607748. Acesso em: 2 set. 2024.https://repositorio.unicamp.br/acervo/detalhe/431576porreponame:Biblioteca Digital de Teses e Dissertações da Universidade Estadual de Campinas (UNICAMP)instname:Universidade Estadual de Campinas (UNICAMP)instacron:UNICAMPinfo:eu-repo/semantics/openAccess2017-02-18T05:17:35Zoai::431576Biblioteca Digital de Teses e DissertaçõesPUBhttp://repositorio.unicamp.br/oai/tese/oai.aspsbubd@unicamp.bropendoar:2017-02-18T05:17:35Biblioteca Digital de Teses e Dissertações da Universidade Estadual de Campinas (UNICAMP) - Universidade Estadual de Campinas (UNICAMP)false
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