Caracterização de alterações moleculares em pacientes com aceruloplasminemia

Detalhes bibliográficos
Autor(a) principal: Borges, Marina Dorigatti, 1994-
Data de Publicação: 2018
Tipo de documento: Dissertação
Idioma: por
Título da fonte: Biblioteca Digital de Teses e Dissertações da Universidade Estadual de Campinas (UNICAMP)
Texto Completo: https://hdl.handle.net/20.500.12733/1634581
Resumo: Orientador: Kleber Yotsumoto Fertrin
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spelling Caracterização de alterações moleculares em pacientes com aceruloplasminemiaCharacterization of molecular changes in patients with aceruloplasminemiaSobrecarga de ferroCeruloplasminaFerritinasIron overloadCeruloplasminFerritinFerroportinFerroportinaOrientador: Kleber Yotsumoto FertrinDissertação (mestrado) - Universidade Estadual de Campinas, Faculdade de Ciências MédicasResumo: A aceruloplasminemia é uma doença hereditária autossômica recessiva causada por mutações no gene CP, que codifica a proteína ceruloplasmina. Ela está envolvida no metabolismo de ferro e alterações na sua função causam o acúmulo intracelular do metal em locais como cérebro, fígado e pâncreas. O diagnóstico é feito com a detecção da ausência de ceruloplasmina sérica associada a exames de neuroimagem sugestivos de sobrecarga de ferro. No Brasil, não se tem dados sobre sua prevalência e sobre quais mutações estão presentes na população. Este projeto teve como objetivo a caracterização das alterações moleculares que acarretam a aceruloplasminemia em pacientes brasileiros. Foram incluídos três pacientes e, quando possível, familiares em primeiro grau, além de um controle saudável e um controle negativo para proteínas ancoradas por GPI (hemoglobinúria paroxística noturna - HPN). Foram coletadas amostras de sangue periférico para a extração de DNA genômico a partir de leucócitos. Fragmentos de interesse no gene CP e no pseudogene CPP, que possui possível associação com a doença, foram amplificados através da reação em cadeia da polimerase (PCR) e sequenciados. Foram avaliadas também as expressões de ferroportina e ceruloplasmina em monócitos de sangue periférico e em macrófagos diferenciados em cultura primária. Os dados dos familiares dos pacientes foram incluídos em uma revisão sistemática sobre os aspectos clínicos e moleculares de portadores de aceruloplasminemia em heterozigose. Duas novas mutações foram encontradas no gene CP: substituição de uma guanina por uma timina na posição 2879-1, mutação splice site (pacientes 1 e 2), e uma troca de timina por citosina na posição 2756 no éxon 16, levando à substituição de leucina por prolina no códon 919, mutação missense (paciente 3). Análise in silico das proteínas mostrou que ocorre mudança significativa na estrutura das proteínas das pacientes em decorrência das mutações. A imunofenotipagem revelou que as expressões observadas nos macrófagos foram similares àquelas vistas nos monócitos. No sangue periférico, houve detecção das proteínas nos monócitos e nos linfócitos B. As expressões encontradas nos linfócitos B foram similares entre os indivíduos, já a presença nos monócitos variou. A mutação CP c.2879-1 G>T apresentou níveis de detecção de ceruloplasmina-GPI e ferroportina semelhantes àqueles encontrados no controle saudável, enquanto que a mutação CP c.2756 T>C levou a redução considerável de ambas proteínas, perfil parecido àquele visto na HPN. Os resultados apoiam a ideia de que a ceruloplasmina-GPI estabiliza a ferroportina na membrana das células, e mostra que as diferentes isoformas da proteína são expressas de forma independente. Quanto aos parentes em primeiro grau, foram incluídos a irmã da paciente 1 e o filho da paciente 3, ambos heterozigotos para a mutação presente na família. Eles apresentavam nível de ceruloplasmina sérica baixo, mas ainda detectável. Através da revisão sistemática, constatou-se que, na literatura, todos os heterozigotos descritos apresentam ceruloplasmina reduzida, mas apenas parte deles manifestou sintomas neurológicos. Este trabalho é pioneiro na caracterização da aceruloplasminemia na população brasileira, sua variabilidade genética e heterogeneidade de expressão clínica, além de contribuir para o maior conhecimento sobre a expressão e importância da ceruloplasmina no nível celularAbstract: Aceruloplasminemia is an autosomal recessive hereditary disease caused by mutations in the CP gene, which encodes ceruloplasmin. This protein is involved in iron metabolism and abnormal function causes the intracellular accumulation of the metal in organs such as the brain, liver, and pancreas. The diagnosis is made upon the detection of absence of serum ceruloplasmin associated with neuroimaging tests suggestive of iron overload. In Brazil, there are no data on its prevalence or on which mutations are present in the population. This project aimed to characterize the molecular alterations that lead to aceruloplasminemia in Brazilian patients. Three patients and, when possible, first-degree relatives were included, as well as a healthy control and a negative control for glycosylphosphaditylinositol-anchored proteins (paroxysmal nocturnal hemoglobinuria - PNH). Peripheral blood samples were collected for the extraction of genomic DNA from leukocytes. Fragments of interest in the CP gene and in the CPP pseudogene, which shows possible association with the disease, were amplified through polymerase chain reaction (PCR) and sequenced. We also evaluated the expression of ferroportin and ceruloplasmin in peripheral blood monocytes and monocyte-derived primary macrophage. Data from first degree relatives of the patients were included in a systematic review of the clinical and molecular aspects of heterozygous aceruloplasminemia. Two new mutations were found in the CP gene: a replacement of a guanine by a thymidine at position 2879-1, a splice site mutation (patients 1 and 2), and a switch of a thymidine by a cytosine at position 2756 in exon 16, leading to a leucine substitution by a proline at codon 919, a missense mutation (patient 3). In silico analysis of the proteins showed that there is significant change in the predicted tertiary structure of the proteins due to these mutations. Immunophenotyping revealed that the protein expressions observed in macrophages were like those seen in monocytes. Both proteins were detected in peripheral blood monocytes and in B lymphocytes. The expressions found in B lymphocytes were similar across all individuals studied, but the expression in monocytes varied. The CP c.2879-1 G>T mutation presented with ceruloplasmin-GPI and ferroportin expressions like those found in a healthy control, whereas the CP c.2756 T>C mutation led to a considerable reduction of both proteins, a profile similar to what was found in PNH. These results support that ceruloplasmin-GPI stabilizes ferroportin in the cell membrane and shows that the different isoforms of the protein are expressed independently across different cell lineages. As for first-degree relatives, patient 1's sister and patient 3's son were confirmed to be heterozygotes for the mutation present in the family. They had low but still detectable levels of serum ceruloplasmin. We performed a systematic review of the scientific literature that showed that all described heterozygotes present reduced ceruloplasmin, but only part of them manifested neurological symptoms. This work pioneers in the characterization of aceruloplasminemia in the Brazilian population, its genetic variability, and heterogeneity of its clinical expression, as well as it contributes to expand the knowledge on the expression and importance of ceruloplasmin at the cellular levelMestradoClínica MédicaMestra em CiênciasFAPESP2016/08072-9[s.n.]Fertrin, Kleber Yotsumoto, 1980-Costa, Fernando FerreiraSaad, Sara Teresinha OlallaGualandro, Sandra Fatima MenosiUniversidade Estadual de Campinas. Faculdade de Ciências MédicasPrograma de Pós-Graduação em Clínica MédicaUNIVERSIDADE ESTADUAL DE CAMPINASBorges, Marina Dorigatti, 1994-20182018-07-03T00:00:00Zinfo:eu-repo/semantics/publishedVersioninfo:eu-repo/semantics/masterThesisapplication/pdf1 recurso online (62 p.) : il., digital, arquivo PDF.https://hdl.handle.net/20.500.12733/1634581BORGES, Marina Dorigatti. Caracterização de alterações moleculares em pacientes com aceruloplasminemia. 2018. 1 recurso online (62 p.) Dissertação (mestrado) - Universidade Estadual de Campinas, Faculdade de Ciências Médicas, Campinas, SP. Disponível em: https://hdl.handle.net/20.500.12733/1634581. Acesso em: 15 mai. 2024.https://repositorio.unicamp.br/acervo/detalhe/1060490Requisitos do sistema: Software para leitura de arquivo em PDFporreponame:Biblioteca Digital de Teses e Dissertações da Universidade Estadual de Campinas (UNICAMP)instname:Universidade Estadual de Campinas (UNICAMP)instacron:UNICAMPinfo:eu-repo/semantics/openAccess2018-10-31T16:45:54Zoai::1060490Biblioteca Digital de Teses e DissertaçõesPUBhttp://repositorio.unicamp.br/oai/tese/oai.aspsbubd@unicamp.bropendoar:2018-10-31T16:45:54Biblioteca Digital de Teses e Dissertações da Universidade Estadual de Campinas (UNICAMP) - Universidade Estadual de Campinas (UNICAMP)false
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