Estudos estrutura-função de fosfolipases 'A IND. 2' D49 e K49 homologa isoladas do veneno de Bothrops jararacussu e Calloselasma rhodostoma : analise comparativa estrutural e biologica

Detalhes bibliográficos
Autor(a) principal: Bonfim Tiburzio, Vera Lucia
Data de Publicação: 2008
Tipo de documento: Tese
Idioma: por
Título da fonte: Biblioteca Digital de Teses e Dissertações da Universidade Estadual de Campinas (UNICAMP)
Texto Completo: https://hdl.handle.net/20.500.12733/1606639
Resumo: Orientadores: Sergio Marangoni, Luis Alberto Ponce-Soto
id UNICAMP-30_6dcbe8f3308acda6ecaba29bd348113f
oai_identifier_str oai::420869
network_acronym_str UNICAMP-30
network_name_str Biblioteca Digital de Teses e Dissertações da Universidade Estadual de Campinas (UNICAMP)
repository_id_str
spelling Estudos estrutura-função de fosfolipases 'A IND. 2' D49 e K49 homologa isoladas do veneno de Bothrops jararacussu e Calloselasma rhodostoma : analise comparativa estrutural e biologicaStudies structure-function of phospholiphse 'A IND. 2' D49 and K49 homologue purified from Bothrops jararacussu and Calloselasma rhodostoma : analyse comparative structure and functionFosfolipases A2Bothrops jararacussuCalloselasma rhodostomaCitotoxicidadePhospholipases A2CytotoxicityOrientadores: Sergio Marangoni, Luis Alberto Ponce-SotoTese (doutorado) - Universidade Estadual de Campinas, Instituto de BiologiaResumo: O envenenamento ofídico é um evento comum nos países pobres da área tropical e subtropical e as conseqüências deste, muito graves. Nestes países, pequena têm sido a valorização destas conseqüências, sendo pouco registradas estatisticamente como casos de saúde pública e muitas vezes tratados com procedimentos pouco efetivos ou ultrapassados. Neste trabalho foram utilizados metodologias refinadas e protocolos otimizados de purificação em HPLC com o intuito de se estudar mais detalhadamente a composição do veneno de duas serpentes de importância médica e epidemiológica, Bothrops jararacussu e Calloselasma rhodostoma, e analisar a relação estrutura função de PLA2 D49 (6-1, 6-2 e Cr-IV1) e PLA2 homólogas K49 (Bj-VII e Cr 5). A Bothrops jararacussu, é uma serpente encontrada nas Américas, desde o México até a Argentina sendo que no Brasil cerca de 90% dos acidentes ofídicos são causados pelo gênero Bothrops. A Calloselasma rhodostoma, é uma serpente amplamente distribuída no sudeste da Ásia e é a causa mais comum de acidentes ofídicos na Malásia e Tailândia. As novas toxinas foram obtidas com alto grau de pureza e homogeneidade molecular, como mostram os perfis cromatográficos, eletroforéticos e de espectrometria de massa por MALDi-TOF. A nova PLA2 D49 foi purificada do veneno de Calloselasma rhodostoma após dois passos cromatográficos: exclusão molecular em uma coluna Protein Pack SW 300 (0,78 cm x 3,30 cm), eluída com 0,25M de bicarbonato de amônio, pH 7,9, a um fluxo de 0,3 ml/min e, fase reversa em HPLC usando uma coluna µ-Bondapack C-18. Esta apresentou atividade fosfolipásica de 14,25±0,36 nmol/mg/min na presença de substrato sintético cromogênico (4-nitro-3-(octanoyloxy) benzoic acid), massa molecular de 14,029 Da determinada através de espectrometria de massa por MALDI-TOF, valor calculado de pI igual a 8.55, caráter básico e grande homologia seqüencial evidenciada pela estrutura primária quando esta é comparada com outras PLA2 D49 provenientes de veneno de serpente. A outra proteína, denominada Cr 5, uma PLA2 homóloga K49 foi isolada do veneno de Calloselasma rhodostoma em um único passo cromatográfico de fase reversa em HPLC (µ-Bondapack C-18). A massa molecular de 13,965 Da foi determinada através de espectrometria de massa por MALDI-TOF. A composição de aminoácido mostrou que a Cr 5 tem alto conteúdo de Lys, Tyr, Gly, Pro e 14 cisteínas, resíduos típicos de uma PLA2 básica. A completa seqüência de aminoácidos da Cr 5 contém 120 resíduos e mostra alta identidade quando comparada a outras PLA2 K49 isoladas de venenos de serpentes da família viperidae. Com relação à caracterização biológica, esta foi realizada também com as isoformas 6-1 e 6-2 (provenientes da fração BthTX-II de Botrhops jararacussu) e com a PLA2 K49 Bj-VII, estas purificadas e parcialmente caracterizadas em trabalho anterior. As PLA2 6-1, 6-2 e Cr-IV 1, exibiram miotoxicidade local e na dosagem de 40 µg/150 µl a 6-1 causou 83,06% de citotoxicidade em miotubos e 93,78% em mioblastos, já a 6-2 75,12 % em miotubos e 86,26% em mioblastos e a Cr-IV 1, 91,50% e 88,40% de citotoxicidade em miotubos e mioblastos, respectivamente. O efeito citotóxico também foi visto em fibroblastos mostrando na dosagem de 5 µM (linhagem 3T3) 85,63%, 86% e 91,34% de citotoxicidade na presença de 6-1, 6-2 e Cr-IV 1 respectivamente, e na linhagem COS7, 95,42%, 95,07% e 96,42% respectivamente, além de atividade inflamatória, sendo esta mais pronunciada na presença da Cr-IV 1. As PLA2s K49 homólogas, Bj-VII e Cr 5, evidenciaram miotoxicidade local e na dosagem de 40 ug/150 µl, a Bj-VII causou 87±50% de lise em mioblastos e 84±85% em miotubos e 91±25% de lise em mioblastos e 91±0.8 % em miotubos quando em contato com a Cr 5, além de atividade inflamatória evidenciada pela indução de edema. No caso destas proteínas, todos os efeitos biológicos induzidos por elas ocorreram na ausência de atividade fosfolipásica mensurável in vitro, suportando a idéia proposta pela literatura de mecanismos catalíticos e farmacológicos independentes. Apesar de todas apresentarem algumas diferenças biológicas, elas possuem um comportamento semelhante na estrutura-função, sugerindo uma ancestralidade comum embora sejam proteínas provenientes de venenos de serpentes separadas geograficamenteAbstract: Snake poisoning is a common event in poor countries of tropical and subtropical areas and the consequences of this is very serious. In these countries, there is the valorization of these consequences, due to few registers of published health cases and a lot of times treated with procedures a little effective or outdated. In this work we refined methodologies and optimized purification protocols used in HPLC with the intention to study the composition of the venom of two serpents of epidemic importance, Bothrops jararacussu and Calloselasma rhodostoma, and to analyze the relationship of structures function of PLA2 D49 (6-1, 6-2 and Cr-IV1) and homologous PLA2 K49 (Bj-VII and Cr 5). Bothrops jararacussu is a serpent found in America, from Mexico to Argentina being in Brazil, about 90% of the snake accidents caused by Bothrops genus. Calloselasma rhodostoma is a serpent thoroughly distributed at the Southwest of Asia and it is the most common cause of snake accidents in Malaysia and Thailand. The new toxins were obtained with high degree of purity and molecular homogeneity, like showed the chromatographics profiles, electrophoresis and MALDi-tof mass spectrometric (MS) analysis. A new D49 PLA2 was purified from the venom of Calloselasma rhodostoma after two chromatographic steps; molecular exclusion was loaded onto a Protein-Pack 300 SW column (0.78 cm 3 30 cm) and eluted with 0.25 M ammonium bicarbonate, pH 7.9, at a flow rate of 0.3 ml/min and reverse phase HPLC on µ-Bondapack C-18 and showed phospholipasic activity of 14.25±0.36 nmol/mg/min in the presence of a synthetic chromogenic substrate (4-nitro-3-(octanoyloxy) benzoic acid), a molecular mass of 14.029 Da was determined by MALDI-TOF mass spectrometry, calculated pI value 8.55, basic character and great sequential homology evidenced by the primary structure when this was compared with other PLA2 from D49 snake venom. The other protein, denominated Cr 5 PLA2 homologous (K49) was isolated from Calloselasma rhodostoma venom in one chromatographic step in reverse phase HPLC (RP-HPLC) (on l-Bondapack C-18). A molecular mass of 13.965 Da was determined by MALDI-TOF mass spectrometry. The amino acid composition showed that Cr 5 had a high content of Lys, Tyr, Gly, Pro, and 14 half-Cys residues, typical residues of a basic PLA2. The complete amino acid sequence of Cr 5 PLA2 contains 120 residues and this sequence shows high identity values when compared to other K49 PLA2s isolated from the venoms of viperid snakes. In relation with biological characterization, this was also done with the isoforms 6-1 and 6-2 (from fraction BthTX-II of Botrhops jararacussu) and with PLA2 K49 Bj-VII, these purified and partially characterized in The Masters. PLA2 6-1, 6-2 and Cr-IV 1 exhibited in mice local myonecrosis and edema upon intramuscular and intravenous injections, respectively. In dosage of 40 ug/150 ml, 6-1 showed 83.06% of citotoxicity in myotubes and 93.78% in myoblasts, 6-2 showed 75,12 % in myotubes and 86,26% in myoblasts, to Cr-IV 1 91.50% and 88.40% of citotoxicity in myoblasts and myotubes respectively. The citotoxic effect also in fibroblasts (cell line 3T3 and COS7) and in dosage de 5 µM (cell line 3T3) 85.63%, 85% and 91.34% of citotoxicity in the presence of 6-1, 6-2 and Cr-IV 1 respectively, and lineage COS7, 95.42%, 95.07 and 96.42% respectively, besides inflammatory activity, being this one more pronounced in the presence of the Cr-IV 1. PLA2 homologue K49, Bj-VII and Cr 5, evidenced local myotoxicity and in dosage of 40 ug/150 ml, showed 87±50 of lise in myoblasts and 84±85 in myotubes and 91±25% and 91±0.8 % when in contact with Bj-VII and Cr 5, respectivally besides of inflammatory activity evidenced by the edema induction. In the case of PLA2 K49 (Bj-VII and Cr 5), all of the biological effects induced by them happened in the absence of activity phospholipase measurable in vitro, supporting the idea proposed by the literature of catalytic and pharmacological mechanisms independent. Even though all show some kind of biologic differences all of them have a similar behave in function and structure which suggests a common ascendance of course we know they are proteins coming from different snakes geographic separated.DoutoradoBioquímicaDoutor em Biologia Funcional e Molecular[s.n.]Marangoni, Sergio, 1951-Ponce-Soto, Luis AlbertoWerneck, Claudio ChrysostomoCogo, José CarlosCintra, Adelia Cristina de OliveiraCarvalho, Daniela Diogenes deUniversidade Estadual de Campinas (UNICAMP). Instituto de BiologiaPrograma de Pós-Graduação em Biologia Funcional e MolecularUNIVERSIDADE ESTADUAL DE CAMPINASBonfim Tiburzio, Vera Lucia20082008-02-25T00:00:00Zinfo:eu-repo/semantics/publishedVersioninfo:eu-repo/semantics/doctoralThesisapplication/pdf115 p. : il.(Broch.)https://hdl.handle.net/20.500.12733/1606639BONFIM TIBURZIO, Vera Lucia. Estudos estrutura-função de fosfolipases 'A IND. 2' D49 e K49 homologa isoladas do veneno de Bothrops jararacussu e Calloselasma rhodostoma: analise comparativa estrutural e biologica. 2008. 115 p. Tese (doutorado) - Universidade Estadual de Campinas, Instituto de Biologia, Campinas, SP. Disponível em: https://hdl.handle.net/20.500.12733/1606639. Acesso em: 2 set. 2024.https://repositorio.unicamp.br/acervo/detalhe/420869porreponame:Biblioteca Digital de Teses e Dissertações da Universidade Estadual de Campinas (UNICAMP)instname:Universidade Estadual de Campinas (UNICAMP)instacron:UNICAMPinfo:eu-repo/semantics/openAccess2017-02-18T05:07:20Zoai::420869Biblioteca Digital de Teses e DissertaçõesPUBhttp://repositorio.unicamp.br/oai/tese/oai.aspsbubd@unicamp.bropendoar:2017-02-18T05:07:20Biblioteca Digital de Teses e Dissertações da Universidade Estadual de Campinas (UNICAMP) - Universidade Estadual de Campinas (UNICAMP)false
dc.title.none.fl_str_mv Estudos estrutura-função de fosfolipases 'A IND. 2' D49 e K49 homologa isoladas do veneno de Bothrops jararacussu e Calloselasma rhodostoma : analise comparativa estrutural e biologica
Studies structure-function of phospholiphse 'A IND. 2' D49 and K49 homologue purified from Bothrops jararacussu and Calloselasma rhodostoma : analyse comparative structure and function
title Estudos estrutura-função de fosfolipases 'A IND. 2' D49 e K49 homologa isoladas do veneno de Bothrops jararacussu e Calloselasma rhodostoma : analise comparativa estrutural e biologica
spellingShingle Estudos estrutura-função de fosfolipases 'A IND. 2' D49 e K49 homologa isoladas do veneno de Bothrops jararacussu e Calloselasma rhodostoma : analise comparativa estrutural e biologica
Bonfim Tiburzio, Vera Lucia
Fosfolipases A2
Bothrops jararacussu
Calloselasma rhodostoma
Citotoxicidade
Phospholipases A2
Cytotoxicity
title_short Estudos estrutura-função de fosfolipases 'A IND. 2' D49 e K49 homologa isoladas do veneno de Bothrops jararacussu e Calloselasma rhodostoma : analise comparativa estrutural e biologica
title_full Estudos estrutura-função de fosfolipases 'A IND. 2' D49 e K49 homologa isoladas do veneno de Bothrops jararacussu e Calloselasma rhodostoma : analise comparativa estrutural e biologica
title_fullStr Estudos estrutura-função de fosfolipases 'A IND. 2' D49 e K49 homologa isoladas do veneno de Bothrops jararacussu e Calloselasma rhodostoma : analise comparativa estrutural e biologica
title_full_unstemmed Estudos estrutura-função de fosfolipases 'A IND. 2' D49 e K49 homologa isoladas do veneno de Bothrops jararacussu e Calloselasma rhodostoma : analise comparativa estrutural e biologica
title_sort Estudos estrutura-função de fosfolipases 'A IND. 2' D49 e K49 homologa isoladas do veneno de Bothrops jararacussu e Calloselasma rhodostoma : analise comparativa estrutural e biologica
author Bonfim Tiburzio, Vera Lucia
author_facet Bonfim Tiburzio, Vera Lucia
author_role author
dc.contributor.none.fl_str_mv Marangoni, Sergio, 1951-
Ponce-Soto, Luis Alberto
Werneck, Claudio Chrysostomo
Cogo, José Carlos
Cintra, Adelia Cristina de Oliveira
Carvalho, Daniela Diogenes de
Universidade Estadual de Campinas (UNICAMP). Instituto de Biologia
Programa de Pós-Graduação em Biologia Funcional e Molecular
UNIVERSIDADE ESTADUAL DE CAMPINAS
dc.contributor.author.fl_str_mv Bonfim Tiburzio, Vera Lucia
dc.subject.por.fl_str_mv Fosfolipases A2
Bothrops jararacussu
Calloselasma rhodostoma
Citotoxicidade
Phospholipases A2
Cytotoxicity
topic Fosfolipases A2
Bothrops jararacussu
Calloselasma rhodostoma
Citotoxicidade
Phospholipases A2
Cytotoxicity
description Orientadores: Sergio Marangoni, Luis Alberto Ponce-Soto
publishDate 2008
dc.date.none.fl_str_mv 2008
2008-02-25T00:00:00Z
dc.type.status.fl_str_mv info:eu-repo/semantics/publishedVersion
dc.type.driver.fl_str_mv info:eu-repo/semantics/doctoralThesis
format doctoralThesis
status_str publishedVersion
dc.identifier.uri.fl_str_mv (Broch.)
https://hdl.handle.net/20.500.12733/1606639
BONFIM TIBURZIO, Vera Lucia. Estudos estrutura-função de fosfolipases 'A IND. 2' D49 e K49 homologa isoladas do veneno de Bothrops jararacussu e Calloselasma rhodostoma: analise comparativa estrutural e biologica. 2008. 115 p. Tese (doutorado) - Universidade Estadual de Campinas, Instituto de Biologia, Campinas, SP. Disponível em: https://hdl.handle.net/20.500.12733/1606639. Acesso em: 2 set. 2024.
identifier_str_mv (Broch.)
BONFIM TIBURZIO, Vera Lucia. Estudos estrutura-função de fosfolipases 'A IND. 2' D49 e K49 homologa isoladas do veneno de Bothrops jararacussu e Calloselasma rhodostoma: analise comparativa estrutural e biologica. 2008. 115 p. Tese (doutorado) - Universidade Estadual de Campinas, Instituto de Biologia, Campinas, SP. Disponível em: https://hdl.handle.net/20.500.12733/1606639. Acesso em: 2 set. 2024.
url https://hdl.handle.net/20.500.12733/1606639
dc.language.iso.fl_str_mv por
language por
dc.relation.none.fl_str_mv https://repositorio.unicamp.br/acervo/detalhe/420869
dc.rights.driver.fl_str_mv info:eu-repo/semantics/openAccess
eu_rights_str_mv openAccess
dc.format.none.fl_str_mv application/pdf
115 p. : il.
dc.publisher.none.fl_str_mv [s.n.]
publisher.none.fl_str_mv [s.n.]
dc.source.none.fl_str_mv reponame:Biblioteca Digital de Teses e Dissertações da Universidade Estadual de Campinas (UNICAMP)
instname:Universidade Estadual de Campinas (UNICAMP)
instacron:UNICAMP
instname_str Universidade Estadual de Campinas (UNICAMP)
instacron_str UNICAMP
institution UNICAMP
reponame_str Biblioteca Digital de Teses e Dissertações da Universidade Estadual de Campinas (UNICAMP)
collection Biblioteca Digital de Teses e Dissertações da Universidade Estadual de Campinas (UNICAMP)
repository.name.fl_str_mv Biblioteca Digital de Teses e Dissertações da Universidade Estadual de Campinas (UNICAMP) - Universidade Estadual de Campinas (UNICAMP)
repository.mail.fl_str_mv sbubd@unicamp.br
_version_ 1809188981129084928

Registros relacionados