Avaliação da importância funcional da triparedoxina peroxidase mitocondrial para o Trypanossoma cruzi

Detalhes bibliográficos
Autor(a) principal: Marinho, Giulia de Andrade, 1993-
Data de Publicação: 2018
Tipo de documento: Dissertação
Idioma: por
Título da fonte: Biblioteca Digital de Teses e Dissertações da Universidade Estadual de Campinas (UNICAMP)
Texto Completo: https://hdl.handle.net/20.500.12733/1634589
Resumo: Orientadores: Fernanda Ramos Gadelha, Eduardo de Figueiredo Peloso
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spelling Avaliação da importância funcional da triparedoxina peroxidase mitocondrial para o Trypanossoma cruziEvaluation of the functional importance of mitochondrial triparedoxyn peroxidase for Trypanossoma cruziTrypanosoma cruziDoença de ChagasPeroxirredoxinasSistema CRISPR/Cas9Trypanosoma cruziChagas¿ diseasePeroxiredoxinsCRISPR/Cas9 systemOrientadores: Fernanda Ramos Gadelha, Eduardo de Figueiredo PelosoDissertação (mestrado) - Universidade Estadual de Campinas, Instituto de BiologiaResumo: O Trypanossoma cruzi é o agente etiológico da doença de Chagas. Atualmente o tratamento é restrito a um único medicamento que não é efetivo na fase crônica e leva a efeitos colaterais sérios. A busca por novos alvos é essencial para o desenvolvimento de um tratamento mais efetivo para a doença. Uma das formas de se avaliar a importância de uma proteína para a sobrevivência de uma célula é através da interrupção da sua expressão. A genética peculiar do T. cruzi não permite que métodos normalmente utilizados em outros tripanosomatídeos, como o RNA de interferência ou knockout, sejam empregados. A técnica do CRISPR-Cas9 descoberta em bactérias, foi adaptada recentemente, com êxito para a obtenção de gene knockout em T. cruzi. O objetivo do presente trabalho foi avaliar os efeitos da ausência da triparedoxina peroxidase mitocondrial (TcMPx) através do knockout realizado com a ferramenta CRISPR/Cas9 em T. cruzi epimastigotas. A TcMPx é de extrema importância para a detoxificação das espécies reativas de oxigênio geradas principalmente pela cadeia respiratória mitocondrial. Nesse sentido, três grupos de células foram eletroporadas: (1) controle (Y); (2) com o vetor pTREX contendo Cas9 e (3) com o vetor pTREX contendo o single guide RNA (sgRNA) e a Cas9 além de um doador de DNA para a recombinação homóloga. As células eletroporadas foram selecionadas com antibióticos com exceção da Y, e após a seleção avaliou-se a bioenergética mitocondrial, taxa de proliferação e morfologia. As células selvagens (Y) e as que expressavam a Cas9 (Ys) apresentaram taxas de proliferação, de consumo de oxigênio semelhantes, indicando que a presença da Cas9 não é tóxica para as células. As células do grupo 3 não sobreviveram ao período de seleção e apresentaram diferenças morfológicas quando comparadas às Y e Ys. Esses resultados sugerem que ou a técnica que apesar de ter sido utilizada de forma satisfatória para outros genes não foi eficaz para o knockout da TcMPx ou essa proteína é essencial para a sobrevivência do parasita. Esses resultados dão suporte a relevante função da TcMPx para o parasita e abrem novos possíveis papéis desempenhados por essa proteína no T. cruziAbstract: Trypanosoma cruzi is the ethiologic agent of Chagas disease. Nowadays, treatment is restricted to only one drug, not effective on the chronic phase leading to serious side effects. The search for new targets is essential for the development of a more effective treatment. One approach to study the relevance of a protein is to interrupt its expression. T. cruzi peculiar genetics does not allow the use of methods currently employed with other trypanosomatids, like interference RNA or knockout. CRISPR-Cas9, discovered in bacteria, was recently adapted successfully to gene knockout in T. cruzi. The aim of the present work was to evaluate the effect of mitochondrial tryparedoxin peroxidase (TcMPx) absence through knockout using CRISPR/Cas9 in T. cruzi epimastigotes. TcMPx is part of the parasite antioxidant defenses and it is extremely vital to the detoxification of reactive oxygen species, generated mainly by the mitochondrial respiratory chain. In this sense, three groups of cells were electroporated: (1) control (Y); (2) with the pTREX vector containing Cas9 and (3) with the pTREX vector containing sgRNA and Cas9 plus a donor DNA for homologous recombination. Electroporated cells were selected with antibiotics, Y being an exception, and after selection mitochondrial bioenergetics, proliferation rates and morphology were evaluated. Wild type (Y) and cells expressing Cas9 (Ys) had similar proliferation and oxygen consumption rates showing that Cas9 expression was not toxic for the cells. Unfortunately, cells from group 3 did not survive through the selection process and showed morphological differences when compared to Y and Ys. These results suggest that or this technique although being used in a successful manner to other genes was not as effective to knockout the TcMPx gene or that this protein is essential to parasite survival. Taking all into consideration these results support the relevance of TcMPx for this parasite and open new possible roles for this protein in T. cruziMestradoBioquímicaMestra em Biologia Funcional e MolecularFAPESP2015/24595-9[s.n.]Gadelha, Fernanda Ramos, 1964-Peloso, Eduardo de Figueiredo, 1976-Miguel, Danilo CicconeMachado, DaisyUniversidade Estadual de Campinas (UNICAMP). Instituto de BiologiaPrograma de Pós-Graduação em Biologia Funcional e MolecularUNIVERSIDADE ESTADUAL DE CAMPINASMarinho, Giulia de Andrade, 1993-20182018-01-12T00:00:00Zinfo:eu-repo/semantics/publishedVersioninfo:eu-repo/semantics/masterThesisapplication/pdf1 recurso online (50 p.) : il., digital, arquivo PDF.https://hdl.handle.net/20.500.12733/1634589MARINHO, Giulia de Andrade. Avaliação da importância funcional da triparedoxina peroxidase mitocondrial para o Trypanossoma cruzi. 2018. 1 recurso online (50 p.) Dissertação (mestrado) - Universidade Estadual de Campinas, Instituto de Biologia, Campinas, SP. Disponível em: https://hdl.handle.net/20.500.12733/1634589. Acesso em: 3 set. 2024.https://repositorio.unicamp.br/acervo/detalhe/1060534Requisitos do sistema: Software para leitura de arquivo em PDFporreponame:Biblioteca Digital de Teses e Dissertações da Universidade Estadual de Campinas (UNICAMP)instname:Universidade Estadual de Campinas (UNICAMP)instacron:UNICAMPinfo:eu-repo/semantics/openAccess2018-10-26T14:06:21Zoai::1060534Biblioteca Digital de Teses e DissertaçõesPUBhttp://repositorio.unicamp.br/oai/tese/oai.aspsbubd@unicamp.bropendoar:2018-10-26T14:06:21Biblioteca Digital de Teses e Dissertações da Universidade Estadual de Campinas (UNICAMP) - Universidade Estadual de Campinas (UNICAMP)false
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