Aplicação da técnica de semeadura na precipitação de proteínas em sistemas complexos : Seeding in bulk protein precipitation

Detalhes bibliográficos
Autor(a) principal: De Biaggi, Juliano Sabedotti, 1991-
Data de Publicação: 2018
Tipo de documento: Dissertação
Idioma: por
Título da fonte: Biblioteca Digital de Teses e Dissertações da Universidade Estadual de Campinas (UNICAMP)
Texto Completo: https://hdl.handle.net/20.500.12733/1634314
Resumo: Orientadores: Everson Alves Miranda, André Bernardo
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spelling Aplicação da técnica de semeadura na precipitação de proteínas em sistemas complexos : Seeding in bulk protein precipitationSeeding in bulk protein precipitationPrecipitaçãoLisozimaEtanolSemeaduraPrecipitationLysozymeEthanolSeedingOrientadores: Everson Alves Miranda, André BernardoDissertação (mestrado) - Universidade Estadual de Campinas, Faculdade de Engenharia QuímicaResumo: Precipitação de proteínas é uma operação dirigida pela supersaturação, resultando na agregação e sedimentação de proteínas em solução, comum nas etapas iniciais do trem de recuperação e purificação de proteínas. A cristalização, também presente em biosseparações, é regida pelo mesmo princípio, porém é projetada para acontecer a supersaturações menores. A transição entre a etapa de nucleação e de crescimento de cristais é um processo difícil de ser atingido de maneira satisfatória. A adição de cristais previamente formados (sementes) à cristalização é uma prática comum que procura evitar a fase de nucleação e o melhor controle da morfologia e distribuição de tamanho dos novos cristais. No entanto, o uso de sementes na precipitação de proteínas é pouco estudado. Um estudo recente mostrou que esta técnica pode ser utilizada para aumentar a recuperação de enzimas em processos de precipitação. O objetivo deste trabalho foi utilizar sementes na precipitação de proteínas em um sistema composto por insulina, lisozima, albumina de soro bovino e tampão, visando estudar o efeito que a semeadura teria na recuperação de atividade enzimática e no hábito cristalino do precipitado. Estudos da solubilidade da insulina mostraram que a proteína apresenta um mínimo de solubilidade em sistema tampão-etanol, possível consequência de a mesma formar diferentes especiações de acordo com o meio em que se encontra. A solubilidade da lisozima e da albumina de soro bovino na sua mistura com tampão decresceu em relação a soluções binárias, tanto aquosas quanto alcoólicas. Este efeito foi possivelmente causado pela interação entre as proteínas em solução, provável consequência da diferença entre as cargas líquidas assumidas para cada proteína no pH selecionado. Os sólidos formados na precipitação das proteínas do sistema complexo com a adição etanol assumiram aspecto de líquido denso em microscopia, indicativo de que o mecanismo de nucleação ocorre em duas etapas. A adição de sementes de lisozima na precipitação com etanol do sistema com 13 mg/mL de proteína, ou diluído 74,6 vezes e dopado com lisozima, não teve efeito na recuperação de atividade enzimática. Foram levantadas três variáveis que podem influenciar a eficácia da semeadura na precipitação de proteínas: diferença entre a estabilidade termodinâmica do precipitado e da semente, concentração inicial de proteínas do sistema complexo e cinética de precipitaçãoAbstract: Protein precipitation relies on a supersaturation driving force, which promotes protein aggregation and sedimentation. It is a unit operation often used at the beginning of protein recovery and purification processes. Crystallization (formation of a solid phase with a well-defined tridimensional shape) also used on bioproduct downstream processing, relies on the same principle, but it is designed to work on a different region of a proteins phase diagram where supersaturation is lower. The transition between crystal formation (nucleation) and crystal growth steps is not easily achieved. A common practice in crystallization is to add previously formed crystals to it to avoid the nucleation phase, and better control crystal shape and size distribution. However, studies of the use of seeds in protein precipitation are scarce. A recent study found that it can increase enzyme recovery in protein precipitation. This project intends to analyze the effect of seeding on yield, purity and precipitate morphology when applied to bulk protein precipitation in a system composed by lysozyme, insulin, bovine serum albumin, phosphate buffer and ethanol. Solubility studies showed that insulin has a solubility minimum in a buffer-ethanol mixture, possibly due to the multiple associated states it can form in solution. Also, the solubility of each selected protein, in the absence or presence of ethanol, was deeply reduced upon their mixing, possibly caused by them interacting with each other, which may be caused by them having opposed charges in the chosen pH. Ethanol bulk protein precipitation yielded solids that turned into a dense liquid phase when analyzed under the microscope, which indicates that precipitates were formed by two-step nucleation mechanism. The addition of lysozyme seeds to the ethanol precipitation of either a 13 mg/mL protein solution or the same solution diluted 74,6 times doped with lysozyme showed no increase in enzyme activity's recovery yield. Three variables may explain how seeding impacts protein precipitation: discrepancies between precipitate and seed thermodynamic stability, too high initial protein concentration or precipitation kineticsMestradoEngenharia QuímicaMestre em Engenharia QuímicaCNPQ134828/2016-0FAPESP2016/21417-5[s.n.]Miranda, Everson Alves, 1959-Bernardo, AndreSeckler, Marcelo MartinsFranco, Luís Fernando MercierUniversidade Estadual de Campinas (UNICAMP). Faculdade de Engenharia QuímicaPrograma de Pós-Graduação em Engenharia QuímicaUNIVERSIDADE ESTADUAL DE CAMPINASDe Biaggi, Juliano Sabedotti, 1991-20182018-07-31T00:00:00Zinfo:eu-repo/semantics/publishedVersioninfo:eu-repo/semantics/masterThesisapplication/pdf1 recurso online (90 p.) : il., digital, arquivo PDF.https://hdl.handle.net/20.500.12733/1634314DE BIAGGI, Juliano Sabedotti. Aplicação da técnica de semeadura na precipitação de proteínas em sistemas complexos: Seeding in bulk protein precipitation. 2018. 1 recurso online (90 p.) Dissertação (mestrado) - Universidade Estadual de Campinas, Faculdade de Engenharia Química, Campinas, SP. Disponível em: https://hdl.handle.net/20.500.12733/1634314. 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