Avaliação da eficácia e segurança de uma estratégia para tratamento da doença falciforme baseada na terapia gênica com um vetor viral para expressão de hemopexina

Detalhes bibliográficos
Autor(a) principal: Lima, Franciele de, 1993-
Data de Publicação: 2023
Tipo de documento: Tese
Idioma: por
Título da fonte: Biblioteca Digital de Teses e Dissertações da Universidade Estadual de Campinas (UNICAMP)
Texto Completo: https://hdl.handle.net/20.500.12733/9444
Resumo: Orientador: Erich Vinicius de Paula
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spelling Avaliação da eficácia e segurança de uma estratégia para tratamento da doença falciforme baseada na terapia gênica com um vetor viral para expressão de hemopexinaEvaluation of efficacy and safety of strategy for the treatment of sickle cell disease based on gene therapy with a viral vector for expression of hemopexinHemopexinaAnemia falciformeInflamaçãoTerapia genéticaVírus adeno-associadosHemopexinSickle cell anemiaInflammationGene therapyAdeno-associated virusOrientador: Erich Vinicius de PaulaTese (doutorado) - Universidade Estadual de Campinas, Faculdade de Ciências MédicasResumo: A anemia falciforme (AF) é a hemoglobinopatia mais frequente no mundo, sendo um dos seus mecanismos patológicos principais a hemólise intravascular crônica. O heme é uma molécula fundamental para diversos processos biológicos, mas em doenças onde ocorre muito hemólise há um aumento de heme livre na circulação que pode ser tóxico para as células e tecidos. A hemopexina (HPX) é uma proteína circulante responsável pela remoção do heme livre da circulação, cujos níveis podem estar esgotados em condições de hemólise crônica, como na AF. Assim, aumentar os níveis de HPX representa uma estratégia atraente para mitigar os efeitos deletérios do heme nessas condições. A terapia gênica com vetores virais adeno-associados (AAV) é uma estratégia de tratamento que nos últimos anos acumulou diversos sucessos em humanos. Nosso objetivo foi usar um vetor baseado em um vírus adeno-associado sorotipo 8 (AAV8) que expressa a proteína HPX humana (hHPX) ou HPX murina (mHPX) em modelos animais de hemólise, avaliando sua eficácia e segurança. Camundongos C57Bl/6j foram injetados com doses do vetor e a expressão foi avaliada por ELISA, Western Blot e qPCR. Além disso, a atividade biológica da hHPX transgênica foi confirmada usando dois modelos diferentes de desafio heme consistindo em injeções seriadas de heme ou hemólise induzida por fenilhidrazina. Também utilizamos um modelo animal de AF, o Townes, para avaliar perfis de segurança e eficácia deste vetor. Em camundongos C57Bl/6j a expressão sustentada de hHPX foi confirmada por até 26 semanas no plasma. A expressão foi dependente da dose e não associada a sinais clínicos de toxicidade. Os níveis de hHPX foram significativamente reduzidos por infusões de heme e hemólise induzida por fenilhidrazina. Nenhuma toxicidade clínica ou sinais laboratoriais de dano hepático foram observados nos estudos de desafio de curto prazo com heme. No modelo Townes, caracterizado por hemólise sustentada, a expressão de hHPX foi confirmada em fígado mas os níveis circulantes não atingiram os patamares esperados. Além disso, utilizando o vetor mHPX, vimos que ele foi capaz de aumentar a expressão de HPX murina em camundongos C57Bl/6j de forma sustentada e dose-dependente. Nos camundongos Townes, observamos um aumento significativo na expressão gênica de mHPX, mas os níveis circulantes permaneceram baixos. Entretanto, notamos uma tendência a ganho de peso nos animais injetados com o vetor mHPX, o que sugere sua eficácia. Nossos resultados confirmam a factibilidade e segurança da transferência gênica da HPX mesmo em modelos de sobrecarga de heme. Além disso, o uso de um vetor que expressa HPX murina se tornou uma estratégia interessante e com maior potencial terapêutico, sugerindo que o uso da mHPX pode modular os parâmetros que não foram capazes de serem avaliados com a hHPXAbstract: Sickle cell anemia (SCA) is the most frequent hemoglobinopathy in the world, one of its main pathological mechanisms being chronic intravascular hemolysis. Heme is a fundamental molecule for several biological processes, but in diseases where there is a lot of hemolysis there is an increase of free heme in the circulation that can be toxic to cells and tissues. Hemopexin (HPX) is a circulating protein responsible for removing free heme from circulation, whose levels may be depleted in conditions of chronic hemolysis, such as in SCA. Thus, increasing HPX levels represents an attractive strategy to mitigate the deleterious effects of heme in these conditions. Gene therapy with adeno-associated viral vectors (AAV) is a treatment strategy that in recent years has accumulated several successes in humans. Our objective was to use a vector based on an adeno-associated virus serotype 8 (AAV8) that expresses human HPX (hHPX) or murine HPX (mHPX) protein in animal models of hemolysis, evaluating its efficacy and safety. C57Bl/6j mice were injected with vector doses and expression was evaluated by ELISA, Western Blot and qPCR. Furthermore, the biological activity of the transgenic hHPX was confirmed using two different models of heme challenge consisting of serial injections of heme or phenylhydrazine-induced hemolysis. We also used an animal model of FA, the Townes, to evaluate safety and efficacy profiles of this vector. In C57Bl/6j mice sustained hHPX expression was confirmed for up to 26 weeks in plasma. Expression was dose-dependent and not associated with clinical signs of toxicity. hHPX levels were significantly reduced by heme infusions and phenylhydrazine-induced hemolysis. No clinical toxicity or laboratory signs of liver damage were observed in the short-term heme challenge studies. In the Townes model, characterized by sustained hemolysis, hHPX expression was confirmed in the liver, but circulating levels did not reach the expected levels. Furthermore, using the mHPX vector, we saw that it was able to increase murine HPX expression in C57Bl/6j mice in a sustained and dose-dependent manner. In Townes mice, we observed a significant increase in mHPX gene expression, but circulating levels remained low. However, we noticed a tendency towards weight gain in animals injected with the mHPX vector, which suggests its effectiveness. Our results confirm the feasibility and safety of HPX gene transfer even in heme overload models. Furthermore, the use of a vector that expresses murine HPX has become an interesting strategy with greater therapeutic potential, suggesting that the use of mHPX can modulate parameters that were not able to be evaluated with hHPXDoutoradoFisiopatologia MédicaDoutora em CiênciasFAPESP2018/23484-7CNPQ442721/2020-0[s.n.]De Paula, Erich Vinicius, 1972-Ozelo, Margareth CastroGonçalves, Marilda de SouzaTraina, FabíolaHounkpe, Bidossessi WilfriedUniversidade Estadual de Campinas (UNICAMP). Faculdade de Ciências MédicasPrograma de Pós-Graduação em Fisiopatologia MédicaUNIVERSIDADE ESTADUAL DE CAMPINASLima, Franciele de, 1993-20232023-03-14T00:00:00Zinfo:eu-repo/semantics/publishedVersioninfo:eu-repo/semantics/doctoralThesisapplication/pdf1 recurso online (92 p.) : il., digital, arquivo PDF.https://hdl.handle.net/20.500.12733/9444LIMA, Franciele de. Avaliação da eficácia e segurança de uma estratégia para tratamento da doença falciforme baseada na terapia gênica com um vetor viral para expressão de hemopexina. 2023. 1 recurso online (92 p.) Tese (doutorado) - Universidade Estadual de Campinas, Faculdade de Ciências Médicas, Campinas, SP. Disponível em: https://hdl.handle.net/20.500.12733/9444. 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