Utilização do método Fluorescence Lifetime Imaging Microscopy na identificação de células hematopoiéticas em esfregaços de medula óssea, sem uso de corantes

Detalhes bibliográficos
Autor(a) principal: Borges da Silva, Fernanda Aparecida, 1990-
Data de Publicação: 2018
Tipo de documento: Dissertação
Idioma: por
Título da fonte: Biblioteca Digital de Teses e Dissertações da Universidade Estadual de Campinas (UNICAMP)
Texto Completo: https://hdl.handle.net/20.500.12733/1636212
Resumo: Orientador: Konradin Metze
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spelling Utilização do método Fluorescence Lifetime Imaging Microscopy na identificação de células hematopoiéticas em esfregaços de medula óssea, sem uso de corantesLabel-free detection of hematopoietc precursours in bone marrow smears by Fluorescence Lifetime Imaging MicroscopyFluorescênciaMedula ósseaHematopoeseMicroscopia confocalFluorescenceBone marrowHematopoiesisMicroscopy, ConfocalOrientador: Konradin MetzeDissertação (mestrado) - Universidade Estadual de Campinas, Faculdade de Ciências MédicasResumo: Durante mais de 100 anos, a coloração de May-Grünwald-Giemsa tem sido utilizada em citologia hematológica. Os avanços recentes na óptica biomédica introduziram novas tecnologias microscópicas que não exigem mais procedimentos de coloração. Neste contexto, a utilização do método FLIM (Fluorescence Lifetime Imaging Microscopy) é de particular interesse, pois cria imagens virtuais com base nas diferenças das características físico-químicas das células sem qualquer procedimento de coloração. Essa técnica se baseia no contraste do tempo de vida dos fluoróforos individuais, medindo o curto atraso entre a absorção de energia de um pulso de laser e a emissão dos fótons de fluorescência pelas moléculas excitadas, atribuindo pseudo-cores artificiais a imagem com base nas diferenças de tempo de vida da fluorescência medidas para cada pixel. Neste estudo retrospectivo utilizamos 32 lâminas de reserva de esfregaços de medula óssea de pacientes que tiveram indicação clínica para realizar mielograma, mas as lâminas de coloração de leishman desses casos, após revisadas confirmaram padrão hematopoiético normal. Os esfregaços não corados foram fixados por vapor de formaldeído, armazenados à temperatura ambiente e posteriormente analisados no microscópio confocal invertido utilizando o método FLIM. O estudo vizou a viabilidade e reprodutibidade do método para diferenciar sem utilizar corantes por meio do tempo de vida da fluorescência, os precursores hematopoiéticos. Os tempos de vida da fluorescência foram significativamente diferentes entre as células (p <0,0001). Os eritrócitos apresentaram os tempos de vida mais baixos. Os núcleos revelaram os valores de tempos de vida mais altos, enquanto que os citoplasmas apresentaram valores mais baixos, sem qualquer excessão (p <0,0001). Mieloblastos e granulócitos maduros apresentaram os maiores valores de tempo de vida, porém sem diferença significativa entre ambos. Os núcleos dos eritroblastos apresentaram o menor tempo de vida. A vida citoplasmática dos mieloblastos foi maior do que a dos eritroblastos e os eritrócitos tiveram os valores mais baixos (todas as diferenças p <0,0001). O citoplasma dos eritroblastos sempre foi azulado, contrastando assim com as cores amarelo-verde do citoplasma da linhagem granulo-mielocitica. Não houve correlações significativas entre os tempos de armazenamento dos esfregaços e os valores FLIM nos diferentes compartimentos celulares. O estudo sugere que a técnica FLIM permite diferenciar facilmente os vários tipos de células em esfregaços de medula óssea de forma reprodutível e permite também visualizar indiretamente a composição molecular predominante dos compartimentos celulares, o que pode gerar novas possibilidades de identificação celular, estudo da fisiopatologia intracelular; e com isso limitar a subjetividade das análises e contribuir para uma possível inovação nas análises da rotina da citologiaAbstract: For more than 100 years, May-Grünwald-Giemsa staining has been used in hematological cytology. Recent advances in biomedical optics have introduced new microscopic technologies that do not require further staining procedures. In this context, the use of FLIM (Fluorescence Lifetime Imaging Microscopy) method is of particular interest because it creates virtual images based on the differences in physicochemical characteristics of cells without any staining procedure. This technique is based on the contrast of the lifetime of the individual fluorophores by measuring the short delay between the energy absorption of a laser pulse and the emission of the fluorescence photons by the excited molecules, assigning artificial pseudo-colors to the image based on the differences of fluorescence lifetimes measured for each pixel. We used 32 reserve slides of bone marrow smears from patients who presented myelogram with clinical indication and normal hematopoietic pattern, where the Leishman staining slides of these cases were reviewed to confirm this pattern. The smears were fixed by formaldehyde vapor, stored at room temperature and then analyzed by the inverted confocal microscope using the FLIM method. The study intends to examine the viability and reproducibility of the method and using the FLIM method, differentiate through the fluorescence life time the hematopoietic precursors without using dyes. Fluorescence lifetimes were significantly different between cells (p <0.0001). The erythrocytes had the lowest lifetimes. The nuclei revealed the highest life-time values, whereas the cytoplasm presented lower values, without any exception (p <0.0001). Myeloblasts and mature granulocytes had the highest values of life time, but without significant difference between both. The nuclei of the erythroblasts had the shortest life time except for erythrocytes (p <0.0001). The cytoplasmic life of the myeloblasts was higher than that of the erythroblasts and the erythrocytes had the lowest values (all differences p <0.0001). The cytoplasm of the erythroblasts has always been bluish, thus contrasting with the yellow-green colors of the cytoplasm of the myeloid lineage. There were no significant correlations between smear storage times and FLIM values in the different cell compartments. The study suggests that the FLIM technique allows to easily differentiate the various types of cells in bone marrow smears reproducible way and also allows to indirectly visualize the predominant molecular composition of the cellular compartments, which can generate new possibilities of identification cells, study of intracellular pathophysiology ; and thus limit / terminate the subjectivity of the analyzes and contribute to a possible innovation in the analysis of routine cytologyMestradoFisiopatologia MédicaMestra em CiênciasCNPQ131518/2016-0[s.n.]Metze, Konradin, 1956-Delamain, Marcia TorresanIkoma, Maura Rosane ValérioUniversidade Estadual de Campinas (UNICAMP). Faculdade de Ciências MédicasPrograma de Pós-Graduação em Fisiopatologia MédicaUNIVERSIDADE ESTADUAL DE CAMPINASBorges da Silva, Fernanda Aparecida, 1990-20182018-01-29T00:00:00Zinfo:eu-repo/semantics/publishedVersioninfo:eu-repo/semantics/masterThesisapplication/pdf1 recurso online (46 p.) : il., digital, arquivo PDF.https://hdl.handle.net/20.500.12733/1636212BORGES DA SILVA, Fernanda Aparecida. Utilização do método Fluorescence Lifetime Imaging Microscopy na identificação de células hematopoiéticas em esfregaços de medula óssea, sem uso de corantes. 2018. 1 recurso online (46 p.) Dissertação (mestrado) - Universidade Estadual de Campinas, Faculdade de Ciências Médicas, Campinas, SP. Disponível em: https://hdl.handle.net/20.500.12733/1636212. 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