A ativação da proteína AMPK pelos ácidos graxos ômega-3 é capaz de proteger a retina contra insultos isquêmicos

Detalhes bibliográficos
Autor(a) principal: Dátilo, Marcella Neves, 1990-
Data de Publicação: 2023
Tipo de documento: Tese
Idioma: por
Título da fonte: Biblioteca Digital de Teses e Dissertações da Universidade Estadual de Campinas (UNICAMP)
Texto Completo: https://hdl.handle.net/20.500.12733/8708
Resumo: Orientador: Jacqueline Mendonça Lopes de Faria
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spelling A ativação da proteína AMPK pelos ácidos graxos ômega-3 é capaz de proteger a retina contra insultos isquêmicosAMPK activation by omega-3 fatty acids protects the retina against ischemic insultsNeovascularizaçãoRetinopatia da prematuridadeSuplementação alimentarGPR120Proteínas quinases ativadas por AMPAngiogenesisRetinopathy of prematuritySupplementationGPR120AMP-Activated protein kinasesOrientador: Jacqueline Mendonça Lopes de FariaTese (doutorado) - Universidade Estadual de Campinas, Faculdade de Ciências MédicasResumo: Introdução: As retinopatias isquêmicas (RIs) são as principais causas de alterações visuais severas, podendo levar à perda de visão. Nesse sentido, o entendimento dos mecanismos relacionados ao desenvolvimento e a elaboração de novas terapêuticas que previnam a progressão da doença são necessários. Diversos mecanismos estão relacionados com a gênese das RIs, dentre elas destaca-se o aumento do processo inflamatório, estresse oxidativo e angiogênese. Evidências sugerem que a ativação da proteína quinase dependente de AMP (AMPK), em células retinianas é capaz de reduzir a inflamação e o estresse oxidativo. Entretanto, o papel da proteína AMPK nas RIs permanece pouco compreendido. Em contrapartida, evidencias também demonstram o papel benéfico dos ácidos graxos poli-insaturados da família do ?3 (?3-PUFAs) no desenvolvimento de retinopatias, porém os mecanismos permanecem pouco elucidados. Em relação à ativação da AMPK, estudos sugerem que a nutrientes, como os ?3-PUFAs são capazes de atuar como ativadores da proteína, porém, o papel do eixo ?3-AMPK no tecido retiniano permanece desconhecido. Objetivo: Avaliar os possíveis efeitos benéficos do ômega-3 em modelo de retinopatia isquêmica e se esses possíveis efeitos podem depender da ativação da proteína AMPK. Métodos: Células endoteliais primárias da microvasculatura da retina humana (hRMECs) foram expostas a um mimético de hipóxia (Dimetiloxalilglicina – DMOG, 400µm), na presença ou ausência de ?3-PUFA (ácido docosaexaenóico – DHA, 50µm), sob silenciamento ou não para a proteína AMPK?. Após os diferentes tratamentos, foram avaliados parâmetros de isquemia, o fenômeno de transição mesenquimal, integridade da barreira endotelial, angiogênese e a atividade da proteína AMPK. Posteriormente, camundongos nocautes para AMPK?2 e seus controles genéticos (C57BL/J6) foram distribuídos nos seguintes grupos experimentais: grupo controle (CT); grupo submetido ao protocolo de retinopatia induzia por oxigênio (OIR); grupo OIR+?3, no qual houve a suplementação materna com 50µL de óleo rico em ?3-PUFAs. Ao final do período experimental, foram avaliados marcadores isquêmicos e de angiogênese através das técnicas de imunofluorescência ou imuno-histoquímica. Resultados: As células expostas ao DMOG apresentaram um aumento na expressão de marcadores hipóxicos, de transição mesenquimal (vimentina), desarranjo da proteína de junção Zônula Occludens-1 (ZO-1), acompanhado de aumento na migração celular e angiogênese quando comparados ao controle (CT) (p<0.05). A exposição ao DMOG reduziu a fosforilação em treonina 172 (Thr172) da AMPK (pAMPKThr172). De maneira interessante, o tratamento com DHA sob condição de isquêmia (DMOG+DHA) foi capaz de restaurar pAMPKThr172 (p<0.05 vs DMOG). O tratamento com DHA aumentou a expressão de seu receptor (GPR120), a concentração intracelular de cálcio e a expressão da proteína a montante da AMPK, CaMKK?. Ainda, o tratamento com DHA restaurou as alterações promovidas pelo DMOG. Sob silenciamento para AMPK? os efeitos benéficos promovidos pelo DHA, foram perdidos. In vivo, camundongos AMPK?2-/- e WT submetidos ao protocolo de OIR apresentaram alterações retinianas morfológicas similares. Por outro lado, a suplementação com óleo rico em ?3-PUFAs foi capaz de atenuar as alterações promovidas pela isquemia apenas em animais WT, reforçando o possível papel da AMPK? nos efeitos benéficos dos ácidos graxos ômega-3 em ambiente isquêmico. Conclusão: O ômega-3 é capaz ativar a proteína AMPK via GPR120-CaMKK? e essa ativação protege a retina contra insultos isquêmicos. Além disso, os efeitos promovidos pelos ?3-PUFAs parecem ser dependentes da ativação da proteína AMPK. As evidências apresentadas nesse estudo podem contribuir para o desenvolvimento de uma nova ferramenta terapêutica para o controle da angiogênese patológica em doenças isquêmicas da retina. No entanto, mais estudos são necessários para a confirmação de tal hipóteseAbstract: Background: Ischemic retinopathies (IRs) are the main causes of severe visual alterations, which can lead to vision loss. Understanding the mechanisms related to disease development and elaborating new therapies to prevent progression are necessary. Several mechanisms are associated with the genesis of IRs, among them the increase in the inflammatory process, oxidative stress, and angiogenesis. Evidence suggests that activation of AMP-dependent protein kinase (AMPK) in retinal cells is able to reduce inflammation and oxidative stress. However, the role of the AMPK protein in IRs remains poorly understood. In addition, evidence also demonstrates the beneficial role of polyunsaturated fatty acids of the ?3 family (?3-PUFAs) in the development of retinopathies, but the mechanisms remain poorly understood. In relation to AMPK activation, studies suggest that nutrients such as ?3-PUFAs can act as protein activators, however, the role of the ?3-AMPK axis in retinal tissue remains unknown. Objective: Evaluate the possible beneficial effects of omega-3 in a model of ischemic retinopathy and whether these effects may depend on the activation of the AMPK protein. Methods: Primary human retinal microvascular endothelial cells (hRMECs) were exposed to a hypoxia mimetic (Dimethyloxalylglycine – DMOG, 400µm), in the presence or absence of ?3-PUFA (docosahexaenoic acid – DHA, 50µm), under silencing for the protein AMPK?. After treatments, ischemia parameters, the mesenchymal transition phenomenon, endothelial barrier integrity, angiogenesis, and AMPK protein activity were evaluated. After that, AMPK?2 knockout mice and their genetic controls (C57BL/J6) were distributed into the following experimental groups: the control group (CT); the group submitted to the oxygen-induced retinopathy (OIR) protocol, and the OIR+?3 group that received a maternal supplementation with 50µL of oil rich in ?3-PUFAs. At the end of the experimental period, ischemic and angiogenesis markers were evaluated using immunofluorescence or immunohistochemistry. Results: Cells exposed to DMOG treatment showed an increase in the expression of hypoxic markers, mesenchymal transition (vimentin), and disruption of the zonula junction protein Occludens-1 (ZO-1), along with an increase in cell migration and angiogenesis when compared to the control (CT) (p<0.05). DMOG exposure reduced threonine 172 (Thr172) phosphorylation of AMPK (pAMPKThr172). Interestingly, DHA treatment under ischemic conditions (DMOG+DHA) was able to restore pAMPKThr172 (p<0.05 vs DMOG). DHA treatment also increased the expression of its receptor (GPR120), the intracellular calcium concentration, and the expression of the AMPK upstream protein, CaMKK?. In addition, DHA treatment restored the alterations promoted by DMOG. However, under AMPK? silencing, the beneficial effects promoted by DHA were lost. In vivo, AMPK?2-/- and WT mice submitted to the OIR protocol showed similar morphological retinal changes. On the other hand, supplementation with oil rich in ?3-PUFAs reduced alterations promoted by ischemia only in WT animals, reinforcing the possible role of AMPK? in the beneficial effects of omega-3 fatty acids in an ischemic environment. Conclusion: Omega-3 fatty acids can activate the AMPK protein via GPR120-CaMKK? protecting the retina against ischemic insults. Furthermore, ?3-PUFAs effects seem to be dependent on the activation of the AMPK. Then, the evidence presented in this study may contribute to the development of a new therapeutic tool to control pathological angiogenesis in retinal ischemic diseases. However, further studies are required to confirm this original hypothesisDoutoradoClínica MédicaDoutora em CiênciasFAPESP2018/07398-3CNPQ142522/2018-0[s.n.]Lopes de Faria, Jacqueline Mendonça, 1966-Hamassaki-Britto, Dania EmiGiannella, Maria Lucia Cardillo CorrêaMelo, Mônica Barbosa deSaad, Sara Teresinha OlallaUniversidade Estadual de Campinas. Faculdade de Ciências MédicasPrograma de Pós-Graduação em Clínica MédicaUNIVERSIDADE ESTADUAL DE CAMPINASDátilo, Marcella Neves, 1990-20232023-03-16T00:00:00Zinfo:eu-repo/semantics/publishedVersioninfo:eu-repo/semantics/doctoralThesisapplication/pdf1 recurso online (131 p.) : il., digital, arquivo PDF.https://hdl.handle.net/20.500.12733/8708DÁTILO, Marcella Neves. A ativação da proteína AMPK pelos ácidos graxos ômega-3 é capaz de proteger a retina contra insultos isquêmicos. 2023. 1 recurso online (131 p.) Tese (doutorado) - Universidade Estadual de Campinas, Faculdade de Ciências Médicas, Campinas, SP. Disponível em: https://hdl.handle.net/20.500.12733/8708. Acesso em: 15 mai. 2024.https://repositorio.unicamp.br/acervo/detalhe/1267295porreponame:Biblioteca Digital de Teses e Dissertações da Universidade Estadual de Campinas (UNICAMP)instname:Universidade Estadual de Campinas (UNICAMP)instacron:UNICAMPinfo:eu-repo/semantics/openAccess2023-04-24T14:24:52Zoai::1267295Biblioteca Digital de Teses e DissertaçõesPUBhttp://repositorio.unicamp.br/oai/tese/oai.aspsbubd@unicamp.bropendoar:2023-04-24T14:24:52Biblioteca Digital de Teses e Dissertações da Universidade Estadual de Campinas (UNICAMP) - Universidade Estadual de Campinas (UNICAMP)false
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