Análise estrutural e funcional de enzimas de "Xanthomonas axonopodis pv citri" potencialmente utilizadas para o catabolismo de compostos aromáticos derivados da lignina

Detalhes bibliográficos
Autor(a) principal: Brilhante, Anna Julyana Viana Chianca, 1996-
Data de Publicação: 2021
Tipo de documento: Dissertação
Idioma: por
Título da fonte: Biblioteca Digital de Teses e Dissertações da Universidade Estadual de Campinas (UNICAMP)
Texto Completo: https://hdl.handle.net/20.500.12733/1367
Resumo: Orientador: Priscila Oliveira de Giuseppe
id UNICAMP-30_b39e0e825c7114b1c63f3073c2bd036e
oai_identifier_str oai::1233285
network_acronym_str UNICAMP-30
network_name_str Biblioteca Digital de Teses e Dissertações da Universidade Estadual de Campinas (UNICAMP)
repository_id_str
spelling Análise estrutural e funcional de enzimas de "Xanthomonas axonopodis pv citri" potencialmente utilizadas para o catabolismo de compostos aromáticos derivados da ligninaStructural and functional analysis of enzymes from "Xanthomonas axonopodis pv citri" potentially used for the catabolism of aromatic compounds derived from ligninAlcool desidrogenaseAldeído desidrogenaseBiotransformaçãoLigninaCompostos aromáticosAlcohol dehydrogenaseAldehyde dehydrogenaseBiotransformationLigninAromatic compoundsOrientador: Priscila Oliveira de GiuseppeDissertação (mestrado) - Universidade Estadual de Campinas, Instituto de BiologiaResumo: A lignina é um heteropolímero aromático de origem vegetal que figura como a segunda maior fonte de carbono orgânico não fóssil na biosfera. Porém, sua recalcitrância e heterogeneidade estrutural impõem desafios técnicos consideráveis para sua conversão em produtos de maior valor agregado. Bactérias do gênero Xanthomonas capazes de catabolizar compostos derivados da lignina são uma potencial fonte de soluções biotecnológicas para essa questão, mas isso ainda é pouco explorado. No genoma de X. axonopodis pv citri 306, identificamos os genes XAC0353 e XAC0354, que codificam proteínas ainda não caracterizadas, com baixa identidade de sequência com proteínas de estrutura conhecida, e potencialmente relacionadas a vias cruciais nos processos de conversão da lignina. Ambos codificam oxidorredutases, sendo XAC0353 predito codificar uma álcool desidrogenase e XAC0354 uma aldeído desidrogenase. Por fazerem parte de um operon putativo, formulamos a hipótese de que XAC0353 e XAC0354 atuam em série na bioconversão de aromáticos de lignina, de modo que o produto da primeira (um aldeído) seja o substrato da segunda. Diante disso, este trabalho teve como objetivo elucidar a estrutura e a função dessas proteínas, utilizando como principais abordagens a cristalografia por difração de raios X e a caracterização bioquímico-cinética dos alvos in vitro. As proteínas foram expressas em E. coli e purificadas à homogeneidade por cromatografia de afinidade e exclusão molecular. XAC0353 forma hexâmeros em solução que aparentemente se combinam em dodecâmeros dependendo da composição do meio, de acordo com ensaios de DLS e SEC-RALS/LALS. XAC0354 forma trímeros com tendência a dissociação em dímeros e monômeros segundo análises de SEC-RALS/LALS. Nos experimentos de cristalização, apenas XAC0353 formou cristais, que difrataram a uma resolução máxima de 3,2 Å. Tentativas de resolução do problema das fases foram bem-sucedidas, mas otimizações serão futuramente realizadas na tentativa de se aumentar a resolução dos dados. Ambas as enzimas têm preferência pelo NAD+ como co-substrato. XAC0353 mostrou alta especificidade para o álcool coniferílico (4,63 x 105 s-1.M-1), sendo inibida por ele a partir de determinadas concentrações (Ki = 3,3 ± 0,3 mM). Além disso, ela apresentou atividade contra o álcool 4-hidroxibenzílico (6,19 x 103 s-1.M-1), o álcool vanílico (3,35 x 103 s-1.M-1) e uma atividade residual contra o álcool benzílico. XAC0354 apresentou o seguinte perfil de especificidade: vanilina (5,30 x 104 s-1.M-1) ~ 4-hidroxibenzaldeído (5,02 x 104 s-1.M-1) > coniferaldeído (3,56 x 104 s-1.M-1) > 3,4-hidroxibenzaldeído (1,41 x 104 s-1.M-1) ~ benzaldeído (1,30 x 104 s-1.M-1) e também apresentou inibição pelo substrato, exceto para o benzaldeído. Diante desses resultados, confirmamos que XAC0353 e XAC0354 apresentam funções bioquímicas que lhes permitem atuar em série na bioconversão de compostos derivados da lignina, revelando-as como enzimas de potencial interesse biotecnológico para valorização desse abundante resíduo agroindustrial. A promiscuidade de substratos observada favorece a exploração e otimização dessas enzimas através de abordagens de engenharia enzimática e evolução dirigida visando aplicações industriais. Estudos futuros a partir de análises estruturais, mutagênese sítio-dirigida e nocauteamento gênico poderão fornecer maiores informações quanto aos mecanismos que regem a especificidade de substratos/co-substratos e sobre a importância fisiológica dessas enzimasAbstract: Lignin is an aromatic heteropolymer of plant origin that figures as the second largest source of non-fossil organic carbon in the biosphere. However, its recalcitrance and structural heterogeneity pose considerable technical challenges for its conversion into higher value-added products. Bacteria of the Xanthomonas genus capable of catabolizing compounds derived from lignin are a potential source of biotechnological solutions for this issue, but this is still little explored. In the genome of X. axonopodis pv citri 306, we identified the genes XAC0353 and XAC0354, which encode uncharacterized proteins, with low sequence identity with proteins of known structure, and potentially related to crucial pathways in the processes of lignin conversion. Both encode oxidoreductases, with XAC0353 being predicted to encode an alcohol dehydrogenase and XAC0354 an aldehyde dehydrogenase. As they belong to a putative operon, we hypothesized that XAC0353 and XAC0354 act in series in the bioconversion of lignin aromatics, so that the product of the first (an aldehyde) is the substrate of the second enzyme. Therefore, this work aimed to elucidate the structure and function of these proteins, using as main approaches X-ray diffraction crystallography and the biochemical-kinetic characterization of the targets in vitro. The proteins were expressed in E. coli and purified to homogeneity by affinity and size exclusion chromatography. XAC0353 forms hexamers in solution that apparently combine into dodecamers depending on the composition of the medium, according to DLS and SEC-RALS/LALS assays. XAC0354 forms trimers with a tendency to dissociate into dimers and monomers according to SEC-RALS/LALS analyses. In the crystallization experiments, only XAC0353 formed crystals, which diffracted at a maximum resolution of 3.2 Å. Attempts to solve the phase problem were successful, but optimizations will be carried out in the future to increase the resolution of the data. Both enzymes prefer NAD+ as a co-substrate. XAC0353 showed high specificity for coniferyl alcohol (4.63 x 105 s-1.M-1), being inhibited by it above certain concentrations (Ki = 3.3 ± 0.3 mM). In addition, it showed activity against 4-hydroxybenzyl alcohol (6.19 x 103 s-1.M-1), vanillyl alcohol (3.35 x 103 s-1.M-1) and a residual activity against benzyl alcohol. XAC0354 showed the following specificity profile: vanillin (5.30 x 104 s-1.M-1) ~ 4-hydroxybenzaldehyde (5.02 x 104 s-1.M-1) > coniferaldehyde (3.56 x 104 s-1.M-1) > 3,4-hydroxybenzaldehyde (1.41 x 104 s-1.M-1) ~ benzaldehyde (1.30 x 104 s-1.M-1) and showed inhibition by the substrate, except for benzaldehyde. These results confirm that XAC0353 and XAC0354 have biochemical functions that allow them to act in series in the bioconversion of compounds derived from lignin, revealing them as enzymes of potential biotechnological interest for the valorization of this abundant agro-industrial residue. The observed substrate promiscuity favors the exploration and optimization of these enzymes through enzymatic engineering and directed evolution approaches aiming industrial applications. Future studies based on structural analyses, site-directed mutagenesis and gene knockout may provide more information about the mechanisms that govern substrate/co-substrate specificity and about the physiological importance of these enzymesMestradoBioquímicaMestra em Biologia Funcional e MolecularCNPQ134268/2019-9FAPESP[s.n.]Giuseppe, Priscila Oliveira deKadowaki, Marco Antonio SeikiNagem, Ronaldo Alves PintoUniversidade Estadual de Campinas. Instituto de BiologiaPrograma de Pós-Graduação em Biologia Funcional e MolecularUNIVERSIDADE ESTADUAL DE CAMPINASBrilhante, Anna Julyana Viana Chianca, 1996-20212021-08-17T00:00:00Zinfo:eu-repo/semantics/publishedVersioninfo:eu-repo/semantics/masterThesisapplication/pdf1 recurso online (114 p.) : il., digital, arquivo PDF.https://hdl.handle.net/20.500.12733/1367BRILHANTE, Anna Julyana Viana Chianca. Análise estrutural e funcional de enzimas de "Xanthomonas axonopodis pv citri" potencialmente utilizadas para o catabolismo de compostos aromáticos derivados da lignina. 2021. 1 recurso online (114 p.) Dissertação (mestrado) - Universidade Estadual de Campinas, Instituto de Biologia, Campinas, SP. Disponível em: https://hdl.handle.net/20.500.12733/1367. Acesso em: 15 mai. 2024.https://repositorio.unicamp.br/acervo/detalhe/1233285Requisitos do sistema: Software para leitura de arquivo em PDFporreponame:Biblioteca Digital de Teses e Dissertações da Universidade Estadual de Campinas (UNICAMP)instname:Universidade Estadual de Campinas (UNICAMP)instacron:UNICAMPinfo:eu-repo/semantics/openAccess2021-11-26T17:38:33Zoai::1233285Biblioteca Digital de Teses e DissertaçõesPUBhttp://repositorio.unicamp.br/oai/tese/oai.aspsbubd@unicamp.bropendoar:2021-11-26T17:38:33Biblioteca Digital de Teses e Dissertações da Universidade Estadual de Campinas (UNICAMP) - Universidade Estadual de Campinas (UNICAMP)false
dc.title.none.fl_str_mv Análise estrutural e funcional de enzimas de "Xanthomonas axonopodis pv citri" potencialmente utilizadas para o catabolismo de compostos aromáticos derivados da lignina
Structural and functional analysis of enzymes from "Xanthomonas axonopodis pv citri" potentially used for the catabolism of aromatic compounds derived from lignin
title Análise estrutural e funcional de enzimas de "Xanthomonas axonopodis pv citri" potencialmente utilizadas para o catabolismo de compostos aromáticos derivados da lignina
spellingShingle Análise estrutural e funcional de enzimas de "Xanthomonas axonopodis pv citri" potencialmente utilizadas para o catabolismo de compostos aromáticos derivados da lignina
Brilhante, Anna Julyana Viana Chianca, 1996-
Alcool desidrogenase
Aldeído desidrogenase
Biotransformação
Lignina
Compostos aromáticos
Alcohol dehydrogenase
Aldehyde dehydrogenase
Biotransformation
Lignin
Aromatic compounds
title_short Análise estrutural e funcional de enzimas de "Xanthomonas axonopodis pv citri" potencialmente utilizadas para o catabolismo de compostos aromáticos derivados da lignina
title_full Análise estrutural e funcional de enzimas de "Xanthomonas axonopodis pv citri" potencialmente utilizadas para o catabolismo de compostos aromáticos derivados da lignina
title_fullStr Análise estrutural e funcional de enzimas de "Xanthomonas axonopodis pv citri" potencialmente utilizadas para o catabolismo de compostos aromáticos derivados da lignina
title_full_unstemmed Análise estrutural e funcional de enzimas de "Xanthomonas axonopodis pv citri" potencialmente utilizadas para o catabolismo de compostos aromáticos derivados da lignina
title_sort Análise estrutural e funcional de enzimas de "Xanthomonas axonopodis pv citri" potencialmente utilizadas para o catabolismo de compostos aromáticos derivados da lignina
author Brilhante, Anna Julyana Viana Chianca, 1996-
author_facet Brilhante, Anna Julyana Viana Chianca, 1996-
author_role author
dc.contributor.none.fl_str_mv Giuseppe, Priscila Oliveira de
Kadowaki, Marco Antonio Seiki
Nagem, Ronaldo Alves Pinto
Universidade Estadual de Campinas. Instituto de Biologia
Programa de Pós-Graduação em Biologia Funcional e Molecular
UNIVERSIDADE ESTADUAL DE CAMPINAS
dc.contributor.author.fl_str_mv Brilhante, Anna Julyana Viana Chianca, 1996-
dc.subject.por.fl_str_mv Alcool desidrogenase
Aldeído desidrogenase
Biotransformação
Lignina
Compostos aromáticos
Alcohol dehydrogenase
Aldehyde dehydrogenase
Biotransformation
Lignin
Aromatic compounds
topic Alcool desidrogenase
Aldeído desidrogenase
Biotransformação
Lignina
Compostos aromáticos
Alcohol dehydrogenase
Aldehyde dehydrogenase
Biotransformation
Lignin
Aromatic compounds
description Orientador: Priscila Oliveira de Giuseppe
publishDate 2021
dc.date.none.fl_str_mv 2021
2021-08-17T00:00:00Z
dc.type.status.fl_str_mv info:eu-repo/semantics/publishedVersion
dc.type.driver.fl_str_mv info:eu-repo/semantics/masterThesis
format masterThesis
status_str publishedVersion
dc.identifier.uri.fl_str_mv https://hdl.handle.net/20.500.12733/1367
BRILHANTE, Anna Julyana Viana Chianca. Análise estrutural e funcional de enzimas de "Xanthomonas axonopodis pv citri" potencialmente utilizadas para o catabolismo de compostos aromáticos derivados da lignina. 2021. 1 recurso online (114 p.) Dissertação (mestrado) - Universidade Estadual de Campinas, Instituto de Biologia, Campinas, SP. Disponível em: https://hdl.handle.net/20.500.12733/1367. Acesso em: 15 mai. 2024.
url https://hdl.handle.net/20.500.12733/1367
identifier_str_mv BRILHANTE, Anna Julyana Viana Chianca. Análise estrutural e funcional de enzimas de "Xanthomonas axonopodis pv citri" potencialmente utilizadas para o catabolismo de compostos aromáticos derivados da lignina. 2021. 1 recurso online (114 p.) Dissertação (mestrado) - Universidade Estadual de Campinas, Instituto de Biologia, Campinas, SP. Disponível em: https://hdl.handle.net/20.500.12733/1367. Acesso em: 15 mai. 2024.
dc.language.iso.fl_str_mv por
language por
dc.relation.none.fl_str_mv https://repositorio.unicamp.br/acervo/detalhe/1233285
Requisitos do sistema: Software para leitura de arquivo em PDF
dc.rights.driver.fl_str_mv info:eu-repo/semantics/openAccess
eu_rights_str_mv openAccess
dc.format.none.fl_str_mv application/pdf
1 recurso online (114 p.) : il., digital, arquivo PDF.
dc.publisher.none.fl_str_mv [s.n.]
publisher.none.fl_str_mv [s.n.]
dc.source.none.fl_str_mv reponame:Biblioteca Digital de Teses e Dissertações da Universidade Estadual de Campinas (UNICAMP)
instname:Universidade Estadual de Campinas (UNICAMP)
instacron:UNICAMP
instname_str Universidade Estadual de Campinas (UNICAMP)
instacron_str UNICAMP
institution UNICAMP
reponame_str Biblioteca Digital de Teses e Dissertações da Universidade Estadual de Campinas (UNICAMP)
collection Biblioteca Digital de Teses e Dissertações da Universidade Estadual de Campinas (UNICAMP)
repository.name.fl_str_mv Biblioteca Digital de Teses e Dissertações da Universidade Estadual de Campinas (UNICAMP) - Universidade Estadual de Campinas (UNICAMP)
repository.mail.fl_str_mv sbubd@unicamp.br
_version_ 1799138566720192512

Registros relacionados