Caracterização da interação da proteína TIPRL com fosfatases tipo 2A em cultura de células

Detalhes bibliográficos
Autor(a) principal: Iacia, Ana Amélia Sanchez, 1985-
Data de Publicação: 2021
Tipo de documento: Tese
Idioma: por
Título da fonte: Biblioteca Digital de Teses e Dissertações da Universidade Estadual de Campinas (UNICAMP)
Texto Completo: https://hdl.handle.net/20.500.12733/1642192
Resumo: Orientador: Juliana Helena Costa Smetana
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spelling Caracterização da interação da proteína TIPRL com fosfatases tipo 2A em cultura de célulasCharacterization of the interaction of the TIPRL protein with type 2A phosphatases in cell cultureFosfatasesProteína TIPRL humanaPhosphatasesTIPRL protein, humanOrientador: Juliana Helena Costa SmetanaTese (doutorado) - Universidade Estadual de Campinas, Instituto de BiologiaResumo: TIPRL (TOR Signaling Pathway Regulator-like) é uma proteína reguladora que interage com as subunidades catalíticas das fosfatases do tipo 2A (PP2A, PP4 e PP6), um conjunto de fosfatases de fosfosserina e fosfotreonina que responde por grande parte dos eventos de desfosforilação intracelulares. Essas fosfatases regulam vários processos celulares, como apoptose, resposta a danos no DNA e divisão celular, e PP2A é um importante supressor tumoral, regulando negativamente diversas vias de sinalização oncogênicas. TIPRL é superexpressa em diversos carcinomas humanos e possivelmente exerce uma função pró-tumoral através da inibição de PP2A por mecanismos ainda pouco compreendidos. TIPRL apresenta um enovelamento único com uma fenda conservada na qual se liga a cauda carboxiterminal conservada da subunidade catalítica da PP2A (PP2Ac), e presumivelmente também de PP4c e PP6c que apresentam similaridade de sequência com PP2Ac nessa região. Essa cauda abriga dois sítios de fosforilação (T304 e T307) e um de carboximetilação (L309), onde sofre modificações pós-traducionais reversíveis que regulam o recrutamento seletivo de subunidades regulatórias. A fosforilação inibe a PP2Ac e prejudica a formação da holoenzima ativa, que é composta por uma subunidade de ancoragem (PR65/A) e um subconjunto de subunidades regulatórias (B, B’, B" e striatinas). Já a metilação é necessária para o recrutamento de algumas subunidades tipo B. TIPRL inibe a atividade de PP2A in vitro, porém o mecanismo de regulação de PP2A por TIPRL na célula ainda não foi elucidado. Mais especificamente, a consequência funcional dessas modificações na interação com TIPRL ainda é desconhecida. Neste trabalho, examinamos a interação entre PP2Ac e TIPRL usando linhagens celulares que expressam de forma estável (NIH/3T3 e N2a), ou transiente (HEK293T), mutantes fosfomiméticos e suas respectivas contrapartes não fosforiláveis, assim como mutantes da leucina no C-terminal da PP2Ac que impedem a carboximetilação. Em análises de imunoprecipitação e Western blot, observamos que a interação de TIPRL é extremamente sensível às mutações no C-terminal da PP2Ac, e também ao pH. A mutação fosfomimética T304D aumentou significativamente a interação de TIPRL com PP2Ac, já as mutações Y307F, Y307E e L309? aboliram completamente a interação. TIPRL interagiu exclusivamente com a versão não metilada da PP2Ac. A superexpressão de TIPRL diminuiu a interação de PP2Ac com a subunidade B em células transfectadas transientemente, mas esse resultado não se reproduziu em linhagens estáveis. Foram analisadas ainda as interações de mutantes da TIPRL com as fosfatases PP2Ac, PP4c e PP6c. Esses mutantes foram selecionados por seu potencial de abolir a interação com a cauda da PP2Ac, porém, alguns deles surpreendentemente tiveram ganho de interação com PP4c e PP6c. As linhagens estáveis desenvolvidas neste trabalho permitiram analisar a interação de TIPRL e PP2Ac de forma semi-quantitativa e reprodutível. A preferência de TIPRL pela versão não metilada de PP2Ac e pelo mutante fosfomimético é T304D condizente com um papel de TIPRL nas etapas iniciais da biogênese da PP2AAbstract: TIPRL (TOR Signaling Pathway Regulator-like) is a regulatory protein that interacts with the catalytic subunits of type 2A phosphatases (PP2A, PP4 and PP6), a set of phosphoserine and phosphothreonine phosphatases that accounts for a large part of intracellular dephosphorylation events. These phosphatases regulate several cellular processes, such as apoptosis, DNA damage response and cell division, and PP2A is an important tumor suppressor, negatively regulating several oncogenic signaling pathways. TIPRL is overexpressed in several human carcinomas and possibly exerts a pro-tumor function through the inhibition of PP2A by mechanisms that are still poorly understood. TIPRL presents a unique folding with a conserved cleft which binds the conserved carboxyterminal tail of the catalytic subunit of PP2A (PP2Ac) and presumably also of PP4c and PP6c that show sequence similarity with PP2Ac in that region. This tail harbors two phosphorylation sites (T304 and T307) and one carboxymethylation site (L309), where it undergoes reversible post-translational modifications that regulate the selective recruitment of regulatory subunits. Phosphorylation inhibits PP2Ac and impairs the formation of the active holoenzyme, which is composed of a scaffold subunit (PR65/A) and a subset of regulatory subunits (B, B', B" and striatins). Methylation is necessary for the recruitment of some B-type subunits. TIPRL inhibits PP2A activity in vitro, but the mechanism for PP2A regulation by TIPRL in the cell has not yet been elucidated. More specifically, the functional consequence of these modifications in the PP2Ac interaction with TIPRL is still unknown. In this study, we examined the interaction between PP2Ac and TIPRL in cell lines using stable (NIH-3T3 and N2a), or transient expression (HEK293T), of phosphomimetic mutants and their respective non-phosphorylable counterparts, as well as deletion of the C-terminal leucine which prevents carboxymethylation. In immunoprecipitation and Western blot analyses, we observed that the TIPRL interaction is extremely sensitive to mutations in the C-terminal of PP2Ac, and also to pH. The T304D phosphomimetic mutation significantly increased the TIPRL interaction with PP2Ac, whereas Y307F, Y307E and L309? mutations completely abolished the interaction. TIPRL interacted exclusively with the non-methylated version of PP2Ac. TIPRL overexpression decreased the interaction of PP2Ac with B subunit in transiently transfected cells, but this result did not reproduce in stable cell lines. The interactions of TIPRL mutants with PP2Ac, PP4c and PP6c were also analyzed. These mutants were selected for their potential to abolish the interaction with the PP2Ac tail, however, some of them surprisingly have gained interaction with PP4c and PP6c. The stable lines developed in this study allowed us to analyze the TIPRL - PP2Ac interaction in a semi-quantitative and reproducible way. The preference of TIPRL for the non-methylated version of PP2Ac and for the phosphomimetic mutant is T304D consistent with a role of TIPRL in the early steps of PP2A biogenesisDoutoradoGenética Animal e EvoluçãoDoutora em Genética e Biologia MolecularFAPESP2016/12560-9CAPES001[s.n.]Smetana, Juliana Helena Costa, 1983-Trindade, Daniel MaragnoPeroni, Luis AntonioFonseca, Matheus de CastroGozzo, Fábio CesarUniversidade Estadual de Campinas (UNICAMP). 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