Estudos biofísicos e bioquímicos de variantes da OXA-143 e sua correlação com os mecanismos de resistência aos antibióticos ß-lactâmicos

Detalhes bibliográficos
Autor(a) principal: Antunes, Víctor Ulian, 1988-
Data de Publicação: 2021
Tipo de documento: Tese
Idioma: por
Título da fonte: Biblioteca Digital de Teses e Dissertações da Universidade Estadual de Campinas (UNICAMP)
Texto Completo: https://hdl.handle.net/20.500.12733/1642060
Resumo: Orientador: Denize Cristina Favaro
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spelling Estudos biofísicos e bioquímicos de variantes da OXA-143 e sua correlação com os mecanismos de resistência aos antibióticos ß-lactâmicosBiophysical and biochemical studies of OXA-143 variants and their correlation with the mechanisms of resistance to ß-lactam antibioticsAntibióticos beta-lactamicosResistência a antimicrobianosBeta-LactamasesBeta-lactam antibioticsAntimicrobial resistanceBeta-LactamasesOrientador: Denize Cristina FavaroTese (doutorado) - Universidade Estadual de Campinas, Instituto de QuímicaResumo: Na era pré-antibióticos, infecções bacterianas eram a principal complicação em cirurgias. Com a descoberta dos antibióticos a medicina evoluiu consideravelmente e cirurgias de rotina se tornaram possíveis, afinal, infecções bacterianas como diarreia e pneumonia se tornaram facilmente tratáveis. Entretanto, o surgimento de bactérias multirresistentes tem modificado gradualmente este cenário. Além de ser uma ameaça ao tratamento eficaz de uma série de infecções, o que torna este um problema eminente e global, com consequências severas à saúde humana, a resistência bacteriana também constitui uma ameaça social e econômica. Dentre as bactérias multirresistentes, frequentemente associadas a surtos de infecções hospitalares, o patógeno Acinetobacter baumannii tem emergido como um desafio ao sistema de saúde moderno. Cepas multirresistentes encontram-se espalhadas mundialmente, constituindo-se como um dos patógenos oportunistas mais perigosos. O principal mecanismo de resistência de cepas de A. baumannii aos ?-lactâmicos, principal classe de antibióticos, consiste na expressão de enzimas ?-lactamases. Nesse contexto, as CHDL (Carbapenem Hydrolyzing Class D ?-lactamases) são frequentemente associadas aos surtos de infecção causados por este patógeno. Devido a uma preferência ancestral pelos substratos oxacilínicos, essas enzimas foram nomeadas como OXAs, entretanto, sua relevância clínica está relacionada à sua capacidade de hidrolisar carbapenêmicos, antibióticos considerados de último recurso. Estruturalmente, as OXAs compartilham os motivos conservados: STFK (posições 81-84), SAV (posições 128-130), FGN (posições 154-156), KSG (posições 218-220) e WLTG (posição 231-234) e os elementos estruturais: loops P (posições 95-119), ? (posições 154-174), e ?5??6 (posições 221-230). No presente trabalho, realizou-se a caracterização biofísica e bioquímica da OXA-143 e suas variantes D224A e P227S com objetivo de investigar a correlação dos aspectos estruturais, de dinâmica conformacional e eficiência catalítica, com a evolução enzimática e resistência bacteriana. Através de experimentos de SEC-MALS, SAXS e RMN observou que as enzimas estudadas são monoméricas em solução e apresentam pouca flexibilidade nas escalas de tempo ps-ms. Além disso, observou-se que a carbamilação da K84 promove uma maior estruturação da proteína, aumentando a estabilidade térmica e a eficiência catalítica. Por sua vez, o efeito de inibição dos íons cloreto, característica em algumas subclasses das OXAs, só foi relevante em condições onde o meio não estava suplementado com bicarbonato. Além disso, investigou-se a importância do elemento estrutural ?5??6 na eficiência catalítica dessa família de enzimas. Os ensaios cinéticos mostraram que a OXA-143 e suas variantes apresentam maior eficiência catalítica (kcat/Km) contra os carbapenêmicos, seguidos das penicilinas e monobactâmicos. Adicionalmente, observou-se que a mutação P227S aumenta a dinâmica conformacional da OXA-143, resultando em maior eficiência catalítica contra todos os ?-lactâmicos testados, especialmente contra compostos volumosos como a ceftazidima, para o qual a P227S foi a única a apresentar atividade. Já a variante D224A apresentou menor eficiência que a enzima selvagem contra todos os substratos testados, exceto contra a oxacilinas. Uma vez que as OXAs surgiram como oxacilinases e tem evoluído para se tornar carbapenemases cada vez mais eficientes, a P227S se mostra como uma mutação convergente no caminho evolutivo da família OXA-143Abstract: In the pre-antibiotic era, bacterial infections were the main complication in surgery. After the discovery of antibiotics, medicine has evolved considerably and routine surgery has become possible, once bacterial infections such as diarrhea and pneumonia have become easily treatable. However, the emergence of multi-resistant bacteria has gradually changed this scenario. In addition to being a threat to the effective treatment of a series of infections, which makes this an eminent and global problem with severe consequences for human health, bacterial resistance is also a social and economic threat. Among the multidrug-resistant bacteria, often associated with outbreaks of nosocomial infections, Acinetobacter baumannii has emerged as one of the most dangerous opportunistic pathogens, constituting a challenge to the modern health system. The main mechanism of resistance of A. baumannii to ?-lactams, the main class of antibiotics, consists of the expression of ?-lactamases enzymes. In this context, Carbapenem Hydrolyzing Class D ?-lactamases (CHDL) are often associated with outbreaks caused by this pathogen. These enzymes are more commonly known as OXAs due to an ancestral preference for oxacillin substrates, even though, their clinical relevance is related to their ability to hydrolyze carbapenems, considered as "last resort" antibiotics. Structurally, the OXA enzymes share the conserved motifs: STFK (positions 81-84), SAV (positions 128-130), FGN (positions 154-156), and KSG (positions 218-220) and WLTG (position 231-234) and the structural elements: loops P (positions 95-119), ? (positions 154-174), and ?5 ? ?6 (positions 221-230). In the present work, the biophysical and biochemical characterization of OXA-143 and its variants D224A and P227S were carried out to investigate the correlation of structural aspects, conformational dynamics, and catalytic efficiency, with enzymatic evolution and bacterial resistance. Experimental assays of SEC-MALS, SAXS, and NMR show that the studied enzymes are monomeric in solution and have little flexibility in the ps-ms time scales. Furthermore, it was observed that carbamylation of the K84 increases stability and catalytic efficiency, while the inhibitory effect of chloride ions, characteristic in some subclasses of OXAs, was relevant only in the absence of bicarbonate. In addition, the importance of the loop ?5??6 in the catalytic efficiency of this family of enzymes was investigated. Kinetic assays showed that the OXA-143 and its variants have higher catalytic efficiency against carbapenems, followed by penicillins and monobactams. Additionally, it was observed that the P227S mutation increases the conformational dynamics of OXA-143, which resulted in increased catalytic efficiency against all tested ?-lactams, especially against bulky compounds such as ceftazidime towards which P227S was the only enzyme to show activity. On the other hand, the D224A variant showed less efficiency than the wild-type enzyme against all tested substrates except oxacillins. Since OXAs have emerged as oxacillinases and have evolved to become increasingly efficient carbapenemases, P227S shows as a convergent mutation in the evolutionary path of the OXA-143 familyDoutoradoQuímica OrgânicaDoutor em CiênciasCAPES001[s.n.]Favaro, Denize Cristina, 1987-Gozzo, Fábio CesarMurakami, Mário TyagoSilva, Adolfo Henrique de MoraesBrandão, Tiago Antônio da SilvaUniversidade Estadual de Campinas (UNICAMP). Instituto de QuímicaPrograma de Pós-Graduação em QuímicaUNIVERSIDADE ESTADUAL DE CAMPINASAntunes, Víctor Ulian, 1988-20212021-06-15T00:00:00Zinfo:eu-repo/semantics/publishedVersioninfo:eu-repo/semantics/doctoralThesisapplication/pdf1 recurso online (137 p.) : il., digital, arquivo PDF.https://hdl.handle.net/20.500.12733/1642060ANTUNES, Víctor Ulian. Estudos biofísicos e bioquímicos de variantes da OXA-143 e sua correlação com os mecanismos de resistência aos antibióticos ß-lactâmicos. 2021. 1 recurso online (137 p.) 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