Estudo do papel de T-bet em macrófagos no modelo de sepse

Detalhes bibliográficos
Autor(a) principal: Costa, Webster Leonardo Guimarães da, 1999-
Data de Publicação: 2023
Tipo de documento: Dissertação
Idioma: por
Título da fonte: Biblioteca Digital de Teses e Dissertações da Universidade Estadual de Campinas (UNICAMP)
Texto Completo: https://hdl.handle.net/20.500.12733/17800
Resumo: Orientador: Pedro Manoel Mendes de Moraes Vieira
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spelling Estudo do papel de T-bet em macrófagos no modelo de sepseStudy on the role of T-bet in macrophages in the sepsis modelGene TBX21Células mieloidesMacrófagosResposta imune - RegulaçãoImunometabolismoTBX21 GeneMyeloid cellsMacrophagesImmune response - RegulationImmunometabolismOrientador: Pedro Manoel Mendes de Moraes VieiraDissertação (mestrado) - Universidade Estadual de Campinas, Instituto de BiologiaResumo: T-bet(Tbx21) foi identificado em linfócitos T auxiliares como responsável pela transativação do gene de Interferon gamma(IFN?) e polarização Th1. T-bet também induz expressão de IFN? em outras células linfoides como células NK, ILC1 e T citotóxicas. Em linfócitos B, T-bet auxilia na troca de isotipo para IgG2a. T-bet tem sido descrito com um papel altamente inflamatório sistemicamente. No entanto, foi descrito que T-bet é um repressor da transcrição do gene de TNF? em células dendríticas, sugerindo um papel regulador. A literatura é rica em estudos que descrevem a função de T-bet nas células linfoides, entretanto, carece de estudos que avaliem especificamente o papel de T-bet na linhagem mieloide, como em macrófagos. Nosso objetivo foi estudar o papel de T-bet em macrófagos. Primeiramente, avaliamos a cinética do mRNA de Tbx21 em BMDMs e observamos que o LPS sozinho não é capaz de modular sua expressão gênica. No entanto, o tratamento com IFN? induziu a expressão de Tbx21 com pico após 3h de estímulo. O estímulo conjunto de LPS+IFN? potencializou a expressão de Tbx21 induzida por IFN?. A polarização de macrófagos com IL-4 não modulou a expressão de Tbx21. Assim, a expressão e função de Tbx21 em macrófagos está relacionada com a polarização do perfil pró-inflamatório e não do perfil alternativo. Análise de Western Blotting revelou que macrófagos M0 expressam T-bet constitutivamente, o que aumenta com estímulo de LPS+IFN? até 12h e decai após 24h de estímulo. Utilizando de BMDM de animais C57BL/6JTbx21f/fLyzMcre(Tbx21-/- na linhagem mieloide), observamos que macrófagos Tbx21-/- tiveram maior expressão gênica e secreção de IL-12 e TNF?, independente da ativação de NF-?B. Demonstramos que T-bet se liga no promotor de Il12 e Tnf?, sugerindo mecanismo de regulação negativa desses genes. Além disso, a deleção de Tbx21 aumentou a expressão de Nos2 e a subsequente produção de NO, com diminuição da expressão de Arg1 em BMDMs. Observamos que T-bet não se liga no promotor de Nos2. Entretanto, como os níveis de NO estavam aumentados nos macrófagos Tbx21-/-, buscamos avaliar se T-bet modularia o metabolismo celular. Macrófagos Tbx21-/- estimulados com LPS+IFN? expressaram mais Slc2a1(GLUT1), Hk2(Hexocinase 2) e Ldh(Lactato Desidrogenase), bem como secretaram maiores níveis de lactato do que BMDMs Tbx21+/+. Observamos também que a Taxa de Acidificação Extracelular(ECAR) está aumentada em macrófagos inflamatórios Tbx21-/-, bem como acidificação não relacionada à glicólise, que pode indicar níveis aumentados de ROS. Confirmamos que macrófagos Tbx21-/- apresentam maiores níveis de H2O2 do que os Tbx21+/+ e apresentam atividade microbicida aumentada, independente de Nox2. Em conjunto, nossos dados indicam que T-bet é importante para manter o tônus inflamatório dos macrófagos regulado. Animais Tbx21f/fLyzMcre apresentam uma capacidade bactericida (fígado/baço) mais efetiva do que Tbx21f/f ao serem infectados com E. coli IP, acompanhado de maiores níveis séricos de IL-1?, marcador de agravamento séptico. Juntos, nossos dados indicam que a deleção de Tbx21 na linhagem mieloide leva a quadros exacerbados de inflamação em camundongos, o que sugere que o T-bet regula o tônus inflamatório de macrófagos em termos de citocinas, metabolismo e função efetoraAbstract: T-bet(Tbx21) was identified in T helper lymphocytes as responsible for the transactivation of the Interferon gamma gene (IFN?) and Th1 polarization. T-bet also induces IFN? expression in other lymphoid cells such as NK, ILC1 and cytotoxic T lymphocytes. In B lymphocytes, T-bet assists in isotype switching to IgG2a. T-bet has been described having a highly inflammatory role systemically. However, it has been reported that T-bet is a transcriptional repressor of the Tnf? gene in dendritic cells, suggesting a regulatory role. The literature is rich in studies that describe the role of T-bet in lymphoid cells, however, there is a lack of studies that specifically assess the role of T-bet in the myeloid lineage, such as in macrophages. Our aim was to study the role of T-bet in macrophages. First, we evaluated the kinetics of Tbx21 mRNA in BMDMs and observed that LPS alone is not able to upregulate its gene expression. However, IFN? treatment upregulated Tbx21 expression with a peak after 3h of stimulation. The joint stimulus of LPS+IFN? potentiated the expression of Tbx21 induced by IFN?. Polarization of macrophages with IL-4 did not modulate Tbx21 expression. Thus, the expression and function of Tbx21 in macrophages is related to the polarization to the pro-inflammatory and not to the alternative profile. Western Blotting analysis revealed that M0 macrophages constitutively express T-bet, which increases with LPS+IFN? stimulation up to 12h and decreases after 24h of stimulation. Using BMDM from C57BL/6JTbx21f/fLyzMcre animals (Tbx21-/- in the myeloid lineage), we observed that Tbx21-/- macrophages had higher gene expression and secretion of IL-12 and TNF?, regardless of NF-?B activation. We demonstrated that T-bet binds to the Il12 and Tnf? promoter, suggesting a negative regulation mechanism for these genes. Furthermore, deletion of Tbx21 increased Nos2 expression and subsequent NO production, with decreased Arg1 expression in BMDMs. We observed that T-bet does not bind to the Nos2 promoter. However, as NO levels were increased in Tbx21-/- macrophages, we sought to assess whether T-bet would modulate cell metabolism. Tbx21-/- macrophages stimulated with LPS+IFN? expressed more Slc2a1(GLUT1), Hk2(Hexokinase 2) and Ldh(Lactate Dehydrogenase), as well as secreted higher levels of lactate than Tbx21+/+ BMDMs. We also observed that the Extracellular Acidification Rate (ECAR) is increased in Tbx21-/- inflammatory macrophages, as well as non-glycolytic acidification, which indicate increased levels of ROS. We confirmed that Tbx21-/- macrophages have higher levels of H2O2 than Tbx21+/+ and have increased microbicidal activity, independent of Nox2. Taken together, our data indicate that T-bet is important for maintaining regulated macrophage inflammatory tone. Tbx21f/fLyzMcre animals have a more effective bactericidal capacity (liver/spleen) than Tbx21f/f when infected with E. coli IP, accompanied by higher serum levels of IL-1?, a marker of septic worsening. Together, our data indicate that deletion of Tbx21 in the myeloid lineage leads to exacerbated inflammation in mice, which suggests that T-bet regulates the inflammatory tonus of macrophages in terms of cytokines, metabolism, and effector functionAbertoMestradoImunologiaMestre em Genética e Biologia MolecularCAPES88887.600680/2021-00FAPESPCNPQ[s.n.]Vieira, Pedro Manoel Mendes de Moraes, 1980-Bortoluci, Karina RamalhoMarques, Rafael EliasUniversidade Estadual de Campinas (UNICAMP). Instituto de BiologiaPrograma de Pós-Graduação em Genética e Biologia MolecularUNIVERSIDADE ESTADUAL DE CAMPINASCosta, Webster Leonardo Guimarães da, 1999-20232023-02-23T00:00:00Zinfo:eu-repo/semantics/publishedVersioninfo:eu-repo/semantics/masterThesisapplication/pdf1 recurso online (63 p.) : il., digital, arquivo PDF.https://hdl.handle.net/20.500.12733/17800COSTA, Webster Leonardo Guimarães da. Estudo do papel de T-bet em macrófagos no modelo de sepse. 2023. 1 recurso online (63 p.) Dissertação (mestrado) - Universidade Estadual de Campinas, Instituto de Biologia, Campinas, SP. Disponível em: https://hdl.handle.net/20.500.12733/17800. Acesso em: 3 set. 2024.https://repositorio.unicamp.br/acervo/detalhe/1386411Cover: https://repositorio.unicamp.br/capa/capa?codigo=1386411Requisitos do sistema: Software para leitura de arquivo em PDFporreponame:Biblioteca Digital de Teses e Dissertações da Universidade Estadual de Campinas (UNICAMP)instname:Universidade Estadual de Campinas (UNICAMP)instacron:UNICAMPinfo:eu-repo/semantics/openAccess2024-05-29T16:42:09Zoai::1386411Biblioteca Digital de Teses e DissertaçõesPUBhttp://repositorio.unicamp.br/oai/tese/oai.aspsbubd@unicamp.bropendoar:2024-05-29T16:42:09Biblioteca Digital de Teses e Dissertações da Universidade Estadual de Campinas (UNICAMP) - Universidade Estadual de Campinas (UNICAMP)false
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