Estudos sobre a clonagem e expressão do gene SEH1 (epóxido hidrolase) de Pichia stipitis EM Pichia pastoris

Detalhes bibliográficos
Autor(a) principal: Rampasio, Raquel Rodrigues, 1986-
Data de Publicação: 2012
Tipo de documento: Dissertação
Idioma: por
Título da fonte: Biblioteca Digital de Teses e Dissertações da Universidade Estadual de Campinas (UNICAMP)
Texto Completo: https://hdl.handle.net/20.500.12733/1619846
Resumo: Orientador: Luciana Gonzaga de Oliveira
id UNICAMP-30_c41b570df9ed59255406f978de742eb0
oai_identifier_str oai::904288
network_acronym_str UNICAMP-30
network_name_str Biblioteca Digital de Teses e Dissertações da Universidade Estadual de Campinas (UNICAMP)
repository_id_str
spelling Estudos sobre a clonagem e expressão do gene SEH1 (epóxido hidrolase) de Pichia stipitis EM Pichia pastorisStudies towards cloning and expression of SEH1 gene (epoxide hydrolase) of Pichia stipitis in Pichia pastorisEpóxido hidrolasePichia stipitisPichia pastorisExpressão heterólogaEpoxide hydrolasePichia stipitisPichia pastorisHeterologous expressionOrientador: Luciana Gonzaga de OliveiraDissertação (mestrado) - Universidade Estadual de Campinas, Instituto de QuímicaResumo: Epóxidos enantiopuros e dióis vicinais têm sido utilizados na síntese de inúeras moléculas bioativas. Dessa forma, as epóxido-hidrolases microbianas capazes de hidrolisar enantioseletivamente epóxidos racêmicos emergiram como uma alternativa promissora na obtenção destes compostos. Recentemente, a linhagem P. stipitis CCT 2617 foi selecionada por apresentar atividade hidrolítica frente a epóxidos terminais e teve seu genoma completo publicado. Assim, esta levedura foi selecionada para o trabalho de clonagem e expressão de sua epóxido hidrolase. Neste trabalho, a clonagem do gene SEH1, que codifica para a epóxido hidrolase de P. stipitis, foi efetuada com sucesso em P. pastoris, tanto no vetor pPICZa A, quanto no vetor pPICZ B. A clonagem da proteína com a cauda de histidina deve auxiliar na detecção da expressão. A detecção de uma banda, referente a uma proteína de 46 kDa, no gel de eletroforese foi um indício de que a expressão da enzima SEH (contendo o fator a) ocorreu, porém, não conseguimos reproduzir este resultado posteriormente. Além disso, buscamos melhores alternativas para a detecção da atividade enzimática, como o teste de adrenalina e o ensaio baseado em substrato fluorogênico, que devem ser aperfeiçoados para a utilização com células íntegras. A modelagem computacional da estrutura tridimensional da PSEH resultou em um modelo contendo 40% de hélices a e 12% de folhas b. Determinamos que os resíduos que devem fazer parte do sítio ativo são Tyr319, Asp209, Asp352 e His383 e, tendo em vista que a PSEH deve se apresentar na forma de um homodímero com sítio ativo similar ao das EHs de P. aeruginosa, A. radiobacter e A. niger, nossa hipótese é que esta enzima deve hidrolisar epóxidos pouco volumosos e aromáticos com algum nível de enantiosseletividadeAbstract: Enantiopure epoxides and vicinal diols have been used to prepare a number of bioactive molecules. Thus, the microbial epoxide hydrolases able to enantioselectivity hydrolyze racemic epoxides emerged as a promising alternative in the synthesis of these compounds. Recently, the P. stipitis CCT2617 strain was selected due to the presence of hydrolytic activity against terminal epoxides and had its genome completely described. Therefore, this yeast was selected for cloning and expression of the gene SEH1, which was annoted as epoxide hydrolase. In this work, the cloning of SEH1 gene, codifying for the epoxide hydrolase of P. stipitis, was done with success in P. pastoris, both in pPICZa A and pPICZ B vectors. The cloning of the protein with a histidine tag should help in the detection of expression. The detection of a protein with 46 kDa evidenced that the expression of SEH enzyme (containing the a factor) is occurring, however, this result was not reproducible due to the sample degradation. Furthermore, better alternatives for the detection of enzyme activity were performed, as adrenaline test and fluorogenic assay, which must be optimized for application with whole cells. The 3D structure computational modeling of PSEH resulted in a model that contains 40% of a helices and 12% of b sheets. Our hypothesis is that the residues that make part of the active site are Tyr319, Asp209, Asp352 and His 383. And, considering that the PSEH should be in the homodimeric form with an active site similar to that of the EHs of P. aeruginosa, A. radiobacter and A. niger, this enzyme should hydrolyze small and aromatic epoxides probably with some enantioselectivityMestradoQuímica OrgânicaMestre em Química[s.n.]Oliveira, Luciana Gonzaga de, 1975-Souza, Anete Pereira deTasic, LjubicaUniversidade Estadual de Campinas. Instituto de QuímicaPrograma de Pós-Graduação em QuímicaUNIVERSIDADE ESTADUAL DE CAMPINASRampasio, Raquel Rodrigues, 1986-2012info:eu-repo/semantics/publishedVersioninfo:eu-repo/semantics/masterThesisapplication/pdf67 f. : il.https://hdl.handle.net/20.500.12733/1619846RAMPASIO, Raquel Rodrigues. Estudos sobre a clonagem e expressão do gene SEH1 (epóxido hidrolase) de Pichia stipitis EM Pichia pastoris. 2012. 67 f. Dissertação (mestrado) - Universidade Estadual de Campinas, Instituto de Química, Campinas, SP. Disponível em: https://hdl.handle.net/20.500.12733/1619846. Acesso em: 15 mai. 2024.https://repositorio.unicamp.br/acervo/detalhe/904288porreponame:Biblioteca Digital de Teses e Dissertações da Universidade Estadual de Campinas (UNICAMP)instname:Universidade Estadual de Campinas (UNICAMP)instacron:UNICAMPinfo:eu-repo/semantics/openAccess2017-02-18T06:55:29Zoai::904288Biblioteca Digital de Teses e DissertaçõesPUBhttp://repositorio.unicamp.br/oai/tese/oai.aspsbubd@unicamp.bropendoar:2017-02-18T06:55:29Biblioteca Digital de Teses e Dissertações da Universidade Estadual de Campinas (UNICAMP) - Universidade Estadual de Campinas (UNICAMP)false
dc.title.none.fl_str_mv Estudos sobre a clonagem e expressão do gene SEH1 (epóxido hidrolase) de Pichia stipitis EM Pichia pastoris
Studies towards cloning and expression of SEH1 gene (epoxide hydrolase) of Pichia stipitis in Pichia pastoris
title Estudos sobre a clonagem e expressão do gene SEH1 (epóxido hidrolase) de Pichia stipitis EM Pichia pastoris
spellingShingle Estudos sobre a clonagem e expressão do gene SEH1 (epóxido hidrolase) de Pichia stipitis EM Pichia pastoris
Rampasio, Raquel Rodrigues, 1986-
Epóxido hidrolase
Pichia stipitis
Pichia pastoris
Expressão heteróloga
Epoxide hydrolase
Pichia stipitis
Pichia pastoris
Heterologous expression
title_short Estudos sobre a clonagem e expressão do gene SEH1 (epóxido hidrolase) de Pichia stipitis EM Pichia pastoris
title_full Estudos sobre a clonagem e expressão do gene SEH1 (epóxido hidrolase) de Pichia stipitis EM Pichia pastoris
title_fullStr Estudos sobre a clonagem e expressão do gene SEH1 (epóxido hidrolase) de Pichia stipitis EM Pichia pastoris
title_full_unstemmed Estudos sobre a clonagem e expressão do gene SEH1 (epóxido hidrolase) de Pichia stipitis EM Pichia pastoris
title_sort Estudos sobre a clonagem e expressão do gene SEH1 (epóxido hidrolase) de Pichia stipitis EM Pichia pastoris
author Rampasio, Raquel Rodrigues, 1986-
author_facet Rampasio, Raquel Rodrigues, 1986-
author_role author
dc.contributor.none.fl_str_mv Oliveira, Luciana Gonzaga de, 1975-
Souza, Anete Pereira de
Tasic, Ljubica
Universidade Estadual de Campinas. Instituto de Química
Programa de Pós-Graduação em Química
UNIVERSIDADE ESTADUAL DE CAMPINAS
dc.contributor.author.fl_str_mv Rampasio, Raquel Rodrigues, 1986-
dc.subject.por.fl_str_mv Epóxido hidrolase
Pichia stipitis
Pichia pastoris
Expressão heteróloga
Epoxide hydrolase
Pichia stipitis
Pichia pastoris
Heterologous expression
topic Epóxido hidrolase
Pichia stipitis
Pichia pastoris
Expressão heteróloga
Epoxide hydrolase
Pichia stipitis
Pichia pastoris
Heterologous expression
description Orientador: Luciana Gonzaga de Oliveira
publishDate 2012
dc.date.none.fl_str_mv 2012
dc.type.status.fl_str_mv info:eu-repo/semantics/publishedVersion
dc.type.driver.fl_str_mv info:eu-repo/semantics/masterThesis
format masterThesis
status_str publishedVersion
dc.identifier.uri.fl_str_mv https://hdl.handle.net/20.500.12733/1619846
RAMPASIO, Raquel Rodrigues. Estudos sobre a clonagem e expressão do gene SEH1 (epóxido hidrolase) de Pichia stipitis EM Pichia pastoris. 2012. 67 f. Dissertação (mestrado) - Universidade Estadual de Campinas, Instituto de Química, Campinas, SP. Disponível em: https://hdl.handle.net/20.500.12733/1619846. Acesso em: 15 mai. 2024.
url https://hdl.handle.net/20.500.12733/1619846
identifier_str_mv RAMPASIO, Raquel Rodrigues. Estudos sobre a clonagem e expressão do gene SEH1 (epóxido hidrolase) de Pichia stipitis EM Pichia pastoris. 2012. 67 f. Dissertação (mestrado) - Universidade Estadual de Campinas, Instituto de Química, Campinas, SP. Disponível em: https://hdl.handle.net/20.500.12733/1619846. Acesso em: 15 mai. 2024.
dc.language.iso.fl_str_mv por
language por
dc.relation.none.fl_str_mv https://repositorio.unicamp.br/acervo/detalhe/904288
dc.rights.driver.fl_str_mv info:eu-repo/semantics/openAccess
eu_rights_str_mv openAccess
dc.format.none.fl_str_mv application/pdf
67 f. : il.
dc.publisher.none.fl_str_mv [s.n.]
publisher.none.fl_str_mv [s.n.]
dc.source.none.fl_str_mv reponame:Biblioteca Digital de Teses e Dissertações da Universidade Estadual de Campinas (UNICAMP)
instname:Universidade Estadual de Campinas (UNICAMP)
instacron:UNICAMP
instname_str Universidade Estadual de Campinas (UNICAMP)
instacron_str UNICAMP
institution UNICAMP
reponame_str Biblioteca Digital de Teses e Dissertações da Universidade Estadual de Campinas (UNICAMP)
collection Biblioteca Digital de Teses e Dissertações da Universidade Estadual de Campinas (UNICAMP)
repository.name.fl_str_mv Biblioteca Digital de Teses e Dissertações da Universidade Estadual de Campinas (UNICAMP) - Universidade Estadual de Campinas (UNICAMP)
repository.mail.fl_str_mv sbubd@unicamp.br
_version_ 1799138507536465920

Registros relacionados