Estudo citoquimico, imunocitoquimico e de analise de imagem de celulas fibroblasticas em proliferação e apoptose na ausencia e presença de colageno tipo I hiperpolimerizado

Detalhes bibliográficos
Autor(a) principal: Maria-Engler, Silvya Stuchi
Data de Publicação: 1998
Tipo de documento: Tese
Idioma: por
Título da fonte: Biblioteca Digital de Teses e Dissertações da Universidade Estadual de Campinas (UNICAMP)
Texto Completo: https://hdl.handle.net/20.500.12733/1586566
Resumo: Orientador: Benedicto de Campos Vidal
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spelling Estudo citoquimico, imunocitoquimico e de analise de imagem de celulas fibroblasticas em proliferação e apoptose na ausencia e presença de colageno tipo I hiperpolimerizadoApoptoseColágenoFibroblastosOrientador: Benedicto de Campos VidalTese (doutorado) - Universidade Estadual de Campinas, Instituto de BiologiaResumo: o presente trabalho é composto de dois estudos, o primeiro que trata a respeito da análise da morte celular por apoptose em células fibroblásticasem culturas confluentes e o segundo, sobre a influênciado substrato à base de colágeno tipo I hiperpolimerizado no crescimento e apoptose de células fibroblásticascultivadas por longo período. As células BHK21 em apoptose, submetidas à reação de Feulgen e a seguir à análise de imagem, demonstraram menor conteúdo de DNA, representado pela diminuição dos valores de IOD (densidade óptica integrada). Após a reação de ConcanavalinaA (Com A), os núcleos apoptóticos exibiram uma maior positividade de reação que os núcleos normais, o que demonstra a presença de glicoproteínas, possivelmente da matriz nuclear, rearranjadas e complexadas ao DNA do núcleo apoptótico. O arranjo ordenado da complexação de glicoproteínas ao DNA foi confirmado através de coloração com ATCEC (azul de toluidina-concentração crítica de eletrólitos), a qual diferencia DNA de RNA, seguida por observação em microscopia de polarização. Células fibroblásticasV79, submetidas à reação de Feulgen e estudadas por análise de imagem, mostraram em culturas confluentes três fenótipos diferentes classificados como normal, suspeito de apoptose e apoptótico. Tal classificação foi feita aliando análise morfológica e avaliação de parâmetros como conteúdo de DNA (IOD), condensação cromatínica em termos de densidade óptica e medidas de área nuclear. Nossos resultados revelaram que a condensação cromatínica aumentou quando comparados os três fenótipos entre si. Foi observado decréscimo nos valores Feulgen-DNA em células apoptóticas e em células suspeitas de apoptose, revelando-se perda de DNA. Em conclusão, destacou-se a importância do método utilizado para caracterizar fases iniciaisdo processo apoptótico e a possibilidade de diagnóstico inequívoco de apoptose, ao utilizar esta metodologia, desde que associada a outras, quer citoquímicas, imunocitoquímicasou bioquímicas. No último estudo, células fibroblásticas V79 foram cultivadas em substrato de colágeno tipo I hiperpolimerizado. Este substrato apresenta características especiais de auto-agregação e é uma estrutura ordenada que mimetiza a estrutura apresentada pelos tendões in vivo. O cultivo celular de longa duração sobre este substrato foi caracterizado por análise de proliferação, diferenciação e morte celular por apoptose, comparado ao crescimento das células sobre lamínulas. A reação de Feulgen, associada à análise de imagem demonstrou que as células apresentaram um aumento no conteúdo de DNA e da condensação cromatínica quando crescidas em substrato colagênico. A proliferação das células V79 sobre colágeno foi menor, refletindo uma fase de latência neste substrato e após o método de TUNEL, específico para detecção de apoptose, observou-se que a morte celular ocorria, porém em tempos de cultivo superiores aqueles observados para células que cresceram sobre lamínula. Demonstrou-se que o substrato colagênico altera o desenvolvimento proliferativo e metabólico dos fibroblastos, características que sugerem a diferenciação celular, e também atrasa, mas não previne o processo apoptóticoAbstract: matrix which were disorganized and complexed to the DNA of apoptotic nuclei. The ordered arrangement of glycoproteins on the DNA was confirmed by TB-CEC (Toluidine blue-critical electrolyte concentration) which diferentiatesDNA ftom RNA after polarization mycroscopy analyses. V79 fibroblast cells submitted to the Feulgen reaction and image analysis of confluent cultures showed three different nuclear phenotypes classified as normal, suspected of apoptosis and apoptotic. This classification were done using morphological analysis and consideration of parameters such as DNA content (IOD), chromatin condensation in terms of optical density (OD) and nuclear area. The results showed that chromatin condensation increased when the three phenotypes were compared. A decrease of Feulgen-DNA values was observed in apoptotic cells and in cells suspected of apoptosis, revealing loss of DNA. In conclusion, this pointed out the importance of this method to characterized early phases of an apoptotic process and the possibility of inequivocal apoptosis diagnosis using this methodology when associated with others, such as cytochemical, immunocytochemical or biochemicalmethods. In the other aprroach, V79 fibroblastic cells were cultured on hyperpolymerized collagen type I substrates. The substrate showed special characteristics of self-assemleyand is an ordered structure that mimics the in vivo tendon. The long-term cell culture on this substrate was characterized by proliferation, differentiation and cell death by apoptosis analysis when compared to cell growth on coverslips. The Feulgen reaction allied to image analysis demonstrated that there is an increase in DNA content and in chromatin condensation when the cells are grow on the collagen substrate. The proliferation of V79 cells on collagen was less than observed for cells grown on a coverslips, which reflects the latency of this substrate. After the apoptosis specific TUNEL method, cell death was found to occur after longer culture periods than for cells grown on coverslips. The collagen substrate alters fibroblast proliferation and morphological aspects, characteristics that suggest cellular differentiation and the delay of apoptosis but not prevent the prevention of the apoptotic processoDoutoradoBioquímicaDoutor em Ciências Biológicas[s.n.]Vidal, Benedicto de Campos, 1930-Mello, Maria Luiza SilveiraZorn, Telma Maria TenorioHaun Quiros, Nora MarcelaLine, Sergio Roberto PeresUniversidade Estadual de Campinas (UNICAMP). Instituto de BiologiaPrograma de Pós-Graduação em Ciências BiológicasUNIVERSIDADE ESTADUAL DE CAMPINASMaria-Engler, Silvya Stuchi19981998-10-15T00:00:00Zinfo:eu-repo/semantics/publishedVersioninfo:eu-repo/semantics/doctoralThesisapplication/pdf75f. : il.https://hdl.handle.net/20.500.12733/1586566MARIA-ENGLER, Silvya Stuchi. Estudo citoquimico, imunocitoquimico e de analise de imagem de celulas fibroblasticas em proliferação e apoptose na ausencia e presença de colageno tipo I hiperpolimerizado. 1998. 75f. Tese (doutorado) - Universidade Estadual de Campinas, Instituto de Biologia, Campinas, SP. Disponível em: https://hdl.handle.net/20.500.12733/1586566. 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