Modificações químicas e caracterização farmacológica das miotoxinas PhTX-I e PhTX-II isoladas do veneno de Porthidium hyoprora

Detalhes bibliográficos
Autor(a) principal: Huancahuire-Vega, Salomón, 1981-
Data de Publicação: 2012
Tipo de documento: Tese
Idioma: por
Título da fonte: Biblioteca Digital de Teses e Dissertações da Universidade Estadual de Campinas (UNICAMP)
Texto Completo: https://hdl.handle.net/20.500.12733/1619508
Resumo: Orientadores: Sergio Marangoni, Luís Alberto Ponce Soto
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spelling Modificações químicas e caracterização farmacológica das miotoxinas PhTX-I e PhTX-II isoladas do veneno de Porthidium hyoproraChemical modifications and pharmacological characterization of PhTX-I and PhTX-II myotoxins isolated from Porthidium hyoproraPorthidium hyoproraMiotoxinaFosfolipases A2Proteinas - Modificações quimicasMiotoxina PhTX-IMiotoxina PhTX-IIPorthidium hyoproraMyotoxinsPhospholipases A2Proteins - Chemical modificationsMyotoxin PhTX-IMyotoxin PhTX-IIOrientadores: Sergio Marangoni, Luís Alberto Ponce SotoTese (doutorado) - Universidade Estadual de Campinas, Instituto de BiologiaResumo: No presente trabalho, a partir do veneno de Porthidium hyoprora, foram purificadas duas fosfolipases A2 (PLA2) miotóxicas, denominadas PhTX-I e PhTX-II, determinadas suas sequências primárias e caracterizadas bioquímica e farmacologicamente. Ambas as proteínas foram purificadas em uma única etapa cromatográfica (HPLC-FR), sendo obtida homogênea e com alto grau de pureza, confirmado por SDS-PAGE, análise de aminoácidos e espectrometria de massas. PhTX-I e PhTX-II estão constituídas de uma única cadeia polipeptídica e possuem massas moleculares de 14.249 e 14.149 Da, respectivamente. A sequência de aminoácidos foi determinada via espectrometria de massas ESI-MS/MS, pertencendo à família das PLA2 D49. A estrutura secundária predominante destas proteínas está constituída de ?-hélices. PhTX-I e PhTX-II induziram atividade paralisante neuromuscular ex vivo na preparação de biventer cervicis de pintainho e esta atividade foi similar ao efeito de outras PLA2 de veneno botrópico. In vivo, tanto PhTX-I quanto PhTX-II, induziram elevada miotoxicidade local e atividade edematogênica. Adicionalmente, PhTX-I induz liberação de IL-6 após injeção intramuscular em camundongos. In vitro, PhTX-I e PhTX-II foram citotóxicas de maneira dose-dependente para as linhagens celulares de fibroblastos NIH-3T3 e NG97 derivada de astrocitoma humano grau III. Adicionalmente PhTX-I foi citotóxica sobre cultura celular de miotubos C2C12, entretanto teve pouco efeito citolítico sobre mioblastos de músculo esquelético. Foram feitas modificações químicas em resíduos de aminoácidos específicos da PhTX-I e avaliadas suas atividades farmacológicas após as modificações. Foram modificados um resíduo de His e Trp, quatro de Tyr e sete de Lys. A análise destas proteínas por dicroísmo circular demonstrou que a estrutura secundária das proteínas modificadas não foi alterada significantemente. Avaliação das atividades biológicas indicam um papel crítico desempenhado pelos aminoácidos Lys e Tyr na miotoxicidade, efeito paralisante neuromuscular e principalmente na citotoxicidade induzida por PhTX-I. A atividade catalítica da PhTX-I é relevante para os efeitos edematogênico, paralisante neuromuscular e miotóxico, mas não para sua atividade citotóxica, pois este efeito foi completamente independente da atividade catalítica de PhTX-I, evidenciando a existência de regiões moleculares, diferentes a do sítio catalítico, as quais podem ser responsáveis por pelo menos algumas das propriedades farmacológicas da PhTX-I. Podemos concluir, que apesar de ser demonstrada uma dissociação parcial, tanto o sítio catalítico como os sítios farmacológicos hipotéticos são relevantes para o perfil farmacológico de PhTX-IAbstract: In this work, were purified two myotoxics phospholipases A2 (PLA2), PhTX-I and PhTX-II, from P. hyoprora snake venom, determined their primary sequences and characterized their pharmacological and biochemical activities. These proteins were purified in a single chromatographic step (FR-HPLC) and obtained with homogeneous and high purity, which was confirmed by SDS-PAGE, amino acid analysis and mass spectrometry. PhTX-I and PhTX-II are constituted of a single polipetide chain and have molecular mass of 14.249 and 14.149 Da, respectively. The amino acid sequence was determined by ESI-MS/MS mass spectrometry; belong to PLA2 D49 family. The predominant secondary structure of these proteins consists of ?-helix. PhTX-I and PhTX-II induced neuromuscular paralyzing effect ex vivo in young chick biventer cervicis preparations, this activity was similar to other PLA2 of snake venom. In vivo, PhTX-I and PhTX -II induced local myotoxicity and edema-forming activity, in addition, PhTX-I induces release of IL-6 after intramuscular injection in mice. In vitro, PhTX-I and PhTX -II were cytotoxic to the fibroblast cell line NIH-3T3 and NG97 derived from grade III human astrocytoma. Additionally PhTX-I induced low cytotoxicity in skeletal muscle myoblasts, however was able to lyse myotubes. Were made modifications chemical in PhTX-I specific amino acid residues and evaluated the pharmacological activities after modifications. Was modified one His and Trp, four Tyr and seven Lys residues? Analysis by circular dichroism demonstrated that secondary structure of protein remains practically unchanged. Evaluation of biological activities indicate a critical role of Lys and Tyr amino acid at myotoxicity, neuromuscular paralyzing effect, and especially cytotoxicity induced by PhTX-I. The catalytic activity of PhTX-I is relevant to the edematogenic, neuromuscular paralyzing and myotoxic effects, but not for their cytotoxic activity, since this effect is completely independent of the catalytic activity of PhTX-I, demonstrating the existence of molecular regions, different from the catalytic site, which may be responsible for at least some of the pharmacological properties of PhTX-I. We conclude that both the catalytic site and the hypothetical pharmacological site(s) are apparently relevant for the pharmacological profile of PhTX-I, although a partial dissociation between these activities has been demonstratedDoutoradoBioquímicaDoutor em Biologia Funcional e Molecular[s.n.]Marangoni, Sergio, 1951-Ponce-Soto, Luis AlbertoTorsoni, Marcio AlbertoCavalcante, Walter Luís GarridoGadelha, Fernanda RamosBonfim Tiburzio, Vera LuciaUniversidade Estadual de Campinas. Instituto de BiologiaPrograma de Pós-Graduação em Biologia Funcional e MolecularUNIVERSIDADE ESTADUAL DE CAMPINASHuancahuire-Vega, Salomón, 1981-20122012-07-11T00:00:00Zinfo:eu-repo/semantics/publishedVersioninfo:eu-repo/semantics/doctoralThesisapplication/pdf87 f. : il.https://hdl.handle.net/20.500.12733/1619508HUANCAHUIRE-VEGA, Salomón. Modificações químicas e caracterização farmacológica das miotoxinas PhTX-I e PhTX-II isoladas do veneno de Porthidium hyoprora. 2012. 87 f. Tese (doutorado) - Universidade Estadual de Campinas, Instituto de Biologia , Campinas, SP. Disponível em: https://hdl.handle.net/20.500.12733/1619508. 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