Caracterização estrutural e bioquimica da hipoxantina-guanina-xantina fosforribosiltransferase

Detalhes bibliográficos
Autor(a) principal: Dantas, Deyse de Souza, 1976-
Data de Publicação: 2008
Tipo de documento: Tese
Idioma: por
Título da fonte: Biblioteca Digital de Teses e Dissertações da Universidade Estadual de Campinas (UNICAMP)
Texto Completo: https://hdl.handle.net/20.500.12733/1607610
Resumo: Orientadores: Gonçalo Amarante Guimarães Pereira, Francisco Javier Medrano Martin
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Os dois primeiros substratos apresentam uma eficiência catalítica semelhante. A xantina apresenta um valor menor (ao redor de 20 vezes mais baixo), mas a constante catalítica é comparável com a da hipoxantina. A proteína não foi capaz de se ligar a GMP-agarose, mas sim pode ligar o outro substrato da reação reversa, pirofosfato inorgânico, com baixa afinidade (Kd = 4,7 ± 0,1 mM). Os dados de espalhamento dinâmico de luz, gel filtração e espalhamento de raios X a baixo ângulo mostram que esta proteína é um homohexâmero em solução. Este hexâmero é compacto e resistente à ação limitada de enzimas proteolíticas. Estudos de estabilidade frente a agentes químicos mostraram que a proteína é bastante estável resistindo os efeitos da uréia sem desenovelar completamente com a maior concentração do agente (8,0 M). Os dados obtidos com cloreto de guanidina mostraram que a proteína possui, no mínimo, um estado intermediário de desnaturação, como mostram os diferentes perfis obtidos com as diferentes técnicas usadas nos estudos de desnaturação. Os dados preliminares obtidos com a HPRT de S. mansoni mostraram que, na presença da cauda de histidinas, a proteína está presente como um octâmero alongado. Mas, muito provavelmente ela deve ser um tetrâmero. A presença de caudas fusionadas nas proteínas recombinantes pode afetar a estrutura e função das proteínasAbstract: The genes that code for the 6-oxopurine phosphoribosyltransferase (HPRT, EC2.4.2.8) from the organisms Pyrococcus horikoshii and Schistosoma mansoni were cloned in expression vectors. The proteins were expressed and purified in large scale in the de Escherichia coli expression system. Kinetic studies showed that the enzyme from P. horikoshii is able to use hypoxanthine, guanine and xanthine. The first two substrates show a similar catalytic efficiency. Xanthine show a lower value (around 20 times), but the catalytic constant is comparable to that of hypoxanthine. The protein was unable to bind to GMP-agarose, but was able to bind the other substrate of the reverse reaction, inorganic pyrophosphate, with low affinity (Kd = 4.7 ± 0.1 mM). Dynamic light scattering, gel filtration and small angle X-ray scattering data show that the protein is a homohexamer in solution. This hexamer is compact and resistant to the limited action of proteolytic enzymes. Stability studies with chemical agents showed that the protein is very stable being able to stand the effects of urea without unfolding completely at the highest agent concentration (8.0 M). Data obtained with guanidine hydrochloride showed that the protein presents, at least, one unfolding intermediate state, as can be seen with the different profiles obtained with different techniques used in the unfolding studies. Preliminary data obtained from HPRT from S. mansoni showed that in the presence of the histidine tag, is present as a long octamer. But, most likely it should be a tetramer. The presence of histidine tag fused to the recombinant proteins could affect the structure and function of proteinsDoutoradoBioquímicaDoutor em Biologia Funcional e Molecular[s.n.]Pereira, Gonçalo Amarante Guimarães, 1964-Medrano, Francisco JavierOliveira, Marcos Antonio deCosta Neto, Cláudio Miguel daBrocchi, MarceloNovello, Jose CamilloUniversidade Estadual de Campinas (UNICAMP). Instituto de BiologiaPrograma de Pós-Graduação em Biologia Funcional e MolecularUNIVERSIDADE ESTADUAL DE CAMPINASDantas, Deyse de Souza, 1976-2008info:eu-repo/semantics/publishedVersioninfo:eu-repo/semantics/doctoralThesisapplication/pdf92f. : il.https://hdl.handle.net/20.500.12733/1607610DANTAS, Deyse de Souza. Caracterização estrutural e bioquimica da hipoxantina-guanina-xantina fosforribosiltransferase. 2008. 92f. 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