Detecção de MYCOPLASMA SP. por PCR para controle de qualidade de imunobiológicos, determinação de concentrações de MYCOPLASMA SP. que afetam culturas celulares e avaliação da filtração na eliminação destes contaminantes

• Autor(a) principal: Netto, Cristiane
• Data de Publicação: 2013
• Tipo de documento: Dissertação
• Idioma: por
• Título da fonte: Repositório Institucional da Universidade Cruzeiro do Sul
• Texto Completo: https://repositorio.cruzeirodosul.edu.br/handle/123456789/2571
• topic: CNPQ::CIENCIAS BIOLOGICAS::BIOLOGIA GERAL; Imunologia; Micoplasma; Controle de qualidade; Reação em cadeia de polimerase

O gênero Mycoplasma, pertencente à classe Mollicutes e são os menores procariotos (0,3 a 0,8 µm). Estão distribuídos na natureza como parasitas de humanos, mamíferos, répteis, peixes, artrópodes e plantas. Sua capacidade de provocar alterações em culturas celulares, evidencia o caráter complexo e singular destes organismos causadores de prejuízos na indústria biotecnológica. A produção de imunobiológicos requer dois produtos essenciais que são soro fetal bovino/ou soro bovino e culturas celulares. Para controle de qualidade destes insumos, na indústria, é fundamental avaliar a presença ou ausência de micoplasmas e determinar o efeito que são capazes de causar em cultivos celulares. Os objetivos deste trabalho são: avaliar se a Reação em cadeia da Polimerase (PCR) poderia ser usada como ferramenta de controle de qualidade, avaliar as concentrações de micoplasma capazes de afetar o crescimento celular e avaliar da eliminação de micoplasmas por filtração em filtros com poros de 0,1 µm. Para atingir estes objetivos foram selecionadas quatro espécies de Mycoplasma (M. orale, M. salivarium, M. arginini e M. hyorhinis) e realizado o cultivo em meio de cultura caldo e ágar SP4. Para a implementação da técnica de PCR, foram utilizados dois métodos de extração de DNA (fenol/clorofórmio e fervura) e selecionados os primers senso GPO-3 e anti-senso MGSO. Após avaliação de sensibilidade e especificidade, desafiouse a metodologia com a pesquisa de micoplasma em soros bovinos e células BHK21. Constatou-se que 56,5 % dos soros bovinos e 15,2 % das culturas de células BHK21 avaliados estavam contaminados por micoplasmas. Os dois testes de contaminação experimental de células BHK21 e Vero com diluições seriadas de M. orale, M. salivarium, M. arginini e M. hyorhinis e a avaliação da eficácia da filtração a 0,1 µm foram determinados através da medida de absorbância e avaliação da porcentagem de redução de crescimento celular. O primeiro teste de contaminação se deu após 24 horas de incubação das células e no segundo teste a partir do tempo zero com total de 48 horas de incubação. Observou-se que as células Vero sofreram maiores efeitos citopáticos que as células BHK21 para os dois testes realizados para mesmas concentrações das cepas utilizadas. Ambas as linhagens de cultivo celular tiveram seus crescimentos afetados em relação ao cultivo controle, especialmente nas primeiras diluições. Portanto, a severidade do efeito citopático é dependente da espécie de micoplasma, da concentração da cepa e do tempo de contato com a cultura celular. A eliminação de micoplasmas por filtração a 0,1 µm se mostrou eficiente apenas para baixas concentrações destes micro-organismos, devido verificação de efeitos citopáticos em cultivos de células BHK21 e Vero com altas concentrações de micoplasmas e a amplificação do fragmento de DNA específico de micoplasmas.