Desenvolvimento de um protocolo de purificação de DNA Plasmidial pela técnica de Salting-out utilizando Sulfato de Amônio

• Autor(a) principal: Pinto, Helber Barboza
• Data de Publicação: 2016
• Tipo de documento: Trabalho de conclusão de curso
• Idioma: por
• Título da fonte: Repositório Institucional da UNIPAMPA
• Texto Completo: http://dspace.unipampa.edu.br/jspui/handle/riu/1403
• topic: DNA; Purification; Salting-out; proteins; DNA; Proteínas; Purificação; Salting-out

O desenvolvimento de protocolos de entrega gênica, como os utilizados para terapia gênica, demanda a obtenção de grandes quantidades de DNA plasmidial (pDNA) com alto grau de pureza. Um dos principais obstáculos da produção de grandes quantidades de pDNA é a própria purificação. Embora existam protocolos de biologia molecular para purificação de pDNA, poucos estão adequados à produção em grande escala e são muito complexos. A técnica de salting-out, onde a precipitação de proteínas e outras biomoléculas é induzida pelo efeito cosmotrópico de alguns sais, pode ser um método simples, rápido e barato de purificação. Com base nesses argumentos, o objetivo deste trabalho foi estabelecer um protocolo de purificação de pDNA a partir da técnica de salting-out utilizando sulfato de amônio. A produção dos plasmídeos foi realizada em células de Escherichia coli da linhagem DH5α e extraído pelo método padrão de lise alcalina. Posteriormente, foi testado o método de salting-out com sulfato de amônio nas concentrações de 1, 2 e 3 M. Simultaneamente, diferentes tempos de exposição ao sal foram testados (10, 20 e 30 minutos). Inicialmente, foram realizados testes de precipitação do DNA com álcool isopropílico na quantidade de 0,7 volumes e, também, precipitação com 2 volumes de álcool etílico para observação da eficiência de ambos perante a presença de sal na amostra. Na presença de álcool etílico tivemos precipitação do sal mesmo em baixas concentrações e na presença de álcool isopropílico aconteceu a formação de duas fases sem a precipitação do sal nem do pDNA. Desta forma, foi testado a diluição das soluções com água ultrapura de 1 M até 0,25 M e posterior precipitação em álcool isopropílico, analisando visualmente a formação ou não das duas fases, que não foi visível a partir da concentração de 0,5 M. Portanto, após o tratamento dos lisados com sulfato de amônio as amostras foram diluídas até a concentração salina de 0,5 M e precipitadas com álcool isopropílico, ressuspendidas em água ultrapura e analisadas em gel de agarose, espectrofotometria, HPLC e transferência gênica. Ao mesmo tempo, comparamos o método salting-out com kit de purificação comercial, visualizando a recuperação de pDNA obtido ao fim do processo e a pureza. Os resultados obtidos mostram a eficiência da técnica de salting-out utilizando sulfato de amônio e precipitação em álcool isopropílico. A concentração de sulfato de amônio 2 M apresentou os melhores resultados com remoção de RNA e padrão eletroforético esperado; Este pDNA apresenta relação 260nm/280nm e 260nm/230nm de acordo com o esperado para DNA puro, posteriormente confirmado por HPLC. Ao mesmo tempo, este DNA apresentou-se eficiente para experimentos de transferência gênica gerando dados compatíveis com aqueles obtidos mediante o uso de colunas cromatográficas comerciais para sua purificação. Assim os dados aqui apresentados sugerem que o método é eficiente, possibilitando a obtenção de pDNA com alto grau de pureza e com baixo custo.