Cultura de células osteogênicas primárias a partir de osso de baixa densidade e análise do reparo ósseo periimplantar em ratas osteoporóticas em função da texturização de superfície por meio da oxidação por plasma eletrolítico

• Autor(a) principal: Silva, William Phillip Pereira da [UNESP]
• Data de Publicação: 2019
• Tipo de documento: Dissertação
• Idioma: por
• Título da fonte: Repositório Institucional da UNESP
• Texto Completo: http://hdl.handle.net/11449/180686
• topic: Oxidação; Osteoporose; Cultura primária de células; Células mesenquimais estromais; Implantes dentários; Oxidation; Osteoporosis; Primary cell culture; Stromal mesenchymal cells; Dental implants

O objetivo deste estudo foi avaliar um novo método de texturização por PEO com incorporação de Ca e P na superfície do Ti-6Al-4V em ossos de baixa densidade, por meio de avaliação in vitro, ex-in vivo e in vivo, em função de parâmetros topográficos e reparacionais. 57 ratas Wistar (Rattus novergicus), sendo 38 ratas com 6 meses de idade (Grupos OXV - submetidas à ovariectomia e SHAM - cirurgia fictícia) e 19 ratas senis (18 meses de idade: Grupo SENIL), foram divididas para realização do estudo ex-in vivo (n=9) e in vivo (n=48). Os grupos para análise ex-in vivo foram submetidos à eutanásia e os fêmures foram removidos e transportados em meio de cultura contendo meio essencial mínimo modificação alfa (α- MEM) suplementado com 500 µg/mL de gentamicina e 3 µg/mL de fungisona. As células-tronco mesenquimais de medula óssea (CTMs-MO) dos fêmures, foram isoladas e cultivadas em meio de crescimento para manterem-se como CTMs. Após alcançar a subconfluência, as células foram cultivadas em 3 superfícies de discos de Ti-6Al-4V, grupo CONTROLE (superfície usinada) grupo AC (superfície tratada por Ataque Ácido e Jateamento) e grupo PEO (superfície tratada por Oxidação de Plasma Eletrolítico com associação de Cálcio e Fosforo). Para avaliação das respostas celulares foram realizados ensaios de viabilidade celular, expressão gênica de marcadores osteoblásticos, imunolocalização de sialoproteina óssea (BSP) e osteopontina (OPN), atividade da fosfatase alcalina (ALP) e formação de matriz mineralizada. Os dados foram submetidos ao teste ANOVA 1 fator ou Kruskal-Wallis (p < 0,05). Nos experimentos in vivo, após 90 dias, foi instalado um implante em cada tíbia, sendo um implante pertencente ao grupo PEO e o outro implante do grupo AC. Após 42 dias da instalação dos implantes, 8 animais de cada grupo foram submetidos à eutanásia e suas tíbias passaram pela descalcificação, para a análise histológica e imunoistoquímica (OPG, RANKL, OC e TRAP). As demais ratas, após a eutanásia, tiveram suas tíbias coletadas e analisadas em microtomografia computadorizada (BV.TV, Tb.Th, Tb.N, Tb.Sp e Po(tot)) e, em seguida os implantes submetidos ao torque reverso em torquímetro digital (N.cm). A outra metade das tíbias foram processadas com inclusão em resina fotopolimerizadas para cortes calcificados e assim, a análise por microscopia confocal (calceina e alizarina) e em seguida, análise histométrica. Os dados foram submetidos ao teste ANOVA 1 fator ou Kruskal-Wallis, seguido de pós teste Tukey; p < 0,05). A análise da viabilidade celular mostrou que em todos os grupos testes de CTMs-MO para SHAM, OVX e SENIL apresentaram um crescimento progressivo nos diferentes tempos de 3, 7 e 10 dias. Avaliação da expressão gênica através dos genes Runx2, SP7/Osterix, ALP, BSP, OC e OPN e analise pela imunofluorecência apresentaram uma leve tendência de melhores respostas nas CTMs-MO SHAM para o grupo AC, CTMs-MO OVX para o grupo PEO e CTMs-MO SENIS características semelhantes nos grupos AC e PEO. A atividade da fosfatase alcalina ocorreu maior expressão na superfície PEO no grupo SHAM, maior expressão na superfície CONTROLE no grupo OVX e no grupo SENIL houve um equilíbrio em todas as superfícies. A superfície PEO apresentou maior formação de nódulos de mineralização (21º dia) em todos os grupos. Nos experimentos in vivo, as análises histológicas mostrou maior neoformação óssea no grupo PEO quando comparado ao grupo AC nos grupos SHAM e OVX, e no grupo SENIL foram similares os resultados. A avaliação imunoistoquímica demonstrou um equilíbrio em todos os grupos na comparação de superfícies na proteína TRAP, para o processo de remodelação (OPG e RANKL) e mineralização (OC) nos grupos SHAM e SENIL (p>0,05), ocorrendo uma diminuição no grupo OVX, no qual os resultados do PEO foram mais favoráveis que AC nessa conformação. Na análise microtomográfica, BV.TV os resultados foram semelhantes em ambos os grupos, porém em OVX AC mostrou menor porcentagem de volume ósseo e uma maior porosidade (Po(tot)). A análise biomecânica por torque-reverso (N.cm) mostrou que os maiores valores pertenciam ao grupo PEO. A dinâmica do tecido ósseo representada pelo turnover ósseo, observado através dos fluorocromos (Calceína e Alizarina) mostrou-se similares nos grupos experimentais. As superficies PEO E AC nesse estudo demonstram que possuem uma grande capacidade de promoção da formação óssea independente dos tipos ósseos experimentais (SHAM, OVX e SENIL), tanto na área de contato osso e implante (ELCOI), quanto para a área de osso neoformado (AON). Diante das limitações do estudo in vitro e in vivo, os resultados foram esclarecedores para acreditar que o método de texturização aqui testado, por meio da Oxidação por Plasma Eletrolítico (PEO), favoreceu à formação óssea, principalmente nos ossos mais críticos (OVX), inclusive evidenciando maior maturação óssea nos períodos mais tardios aqui analisados.